2. Разрешающая способность и полезное увеличение микроскопа.

Соответствующим подбором линз можно обеспечить весьма большое увеличение микроскопа. Однако на практике редко используют увеличение, превышающее 1500-2000 раз. Это объясняется тем, что возможность различать мелкие детали объекта нарушается дифракционными явлениями, которые ограничивают полезное увеличение микроскопа. При прохождении света через мельчайшие детали предмета изображение их вследствие дифракции может терять резкость, может возникнуть нарушение геометрического подобия предмета, и, наконец, возможно полное исчезновение изображения. Чтобы детально выяснить причины данного явления, ознакомимся с понятиями: « разрешающая способность», «предел разрешения», «полезное увеличение».

Разрешающая способность (R) – это способность микроскопа давать раздельные изображения мелких деталей рассматриваемого объекта.

Предел разрешения (Z) – это такое наименьшее расстояние между двумя точками объекта, когда эти точки видны в микроскопе раздельно. Разрешающая способность обратна пределу разрешения . Разрешающая способность микроскопа обусловлена волновыми свойствами света, поэтому выражение для предела разрешения можно получить учитывая дифракционные явления.

Дифракционная теория разрешающей способности микроскопа разработана Э.Аббе, Л.Мандельштамом и Д.Рожденственским. Разрешающая способность микроскопа в целом определяется разрешающей способности объектива, в который непосредственно входят лучи света, дифрагированные на объекте.

О сновным элементом, обуславливающим разрешающую способность объектива, является его апертурный угол α (рис.2), равный половине угла, образованного лучами, идущими от препарата к краям объектива (отверстный угол U). Апертурный угол определяет угловой размер объектива и играет большую роль в достижении большой разрешающей способности микроскопа. Рассмотрим образование с помощью объектива изображения светящегося отверстия S достаточно малого диаметра d, на которое падает пучок параллельных монохроматических лучей (рис.3). Проходя через отверстие, свет испытывает дифракцию. Объектив собирает лучи и в сопряжённой плоскости образует в точке A изображение отверстия . Возможны два случая:

1) Апертурный угол α объектива больше угла дифракции φ или равен ему (α≥φ), тогда все дифрагирующие лучи принимают участие в формировании изображения и оно будет подобно предмету.

2) Апертурный угол α<φ, тогда не все исходящие из отверстия лучи примут участие в образовании изображения предмета. Изображение не будет полностью геометрически подобно предмету.

Степень нарушения изображения будет зависеть от того, какая часть дифрагирующих лучей не попадает в объектив и не принимает участие в образовании изображения. Угол φ дифракции лучей тем больше, чем больше длина волны λ и чем меньше диаметр d отверстия. Тогда в предельном случае, когда α= φ, можно установить аналогичное соотношение , откуда .

Таким образом, диаметр отверстия, при котором сохраняется подобие изображения предмету, может быть тем меньше, чем короче длина волны и чем больше апертурный угол.

Перенеся рассуждения на условия микроскопирования, можно считать, что диаметр d отверстия соответствует наименьшему размеру структурных деталей препарата, т.е. приравнять его к пределу разрешения объектива микроскопа Z=d. Тогда аналогичное утверждение можно привести относительно разрешения объектива.

В теории Аббе в качестве микроскопируемого объекта рассматривается дифракционная решётка. В оптических устройствах, в том числе и в микроскопе, пучки света всегда ограничены, поэтому важно знать, как это повлияет на искажение изображения предмета, какое минимальное количество лучей способно передавать полную информацию о предмете. Аббе в своих опытах экранировал в плоскости F собирающей линзы часть лучей, дающих изображение дифракционной решётки. Он установил, что для разрешения щелей в изображении дифракционной решётки, полученном с помощью линзы на экране, необходимо, чтобы в образовании её изображения участвовали лучи от максимумов нулевого и первого порядков, хотя бы с одной стороны. В предельном случае, согласно Аббе, крайними лучами ограниченного конического светового пучка будут лучи, соответствующие центральному (нулевому) и 1-му главному максимуму. Предел разрешения в этом случае может быть приравнен периоду дифракционной решётки (d). Тогда, используя формулу дифракционной решётки , (к=1; φ =α; d=Z) для перпендикулярного падения лучей в воздухе можно записать: ; т.е. предел разрешения при прямом падении лучей численно равен отношению длины волны света к синусу апертурного угла объектива.

П усть свет падает на дифракционную решётку под углом падения , равным апертурному углу (рис.4). В этом случае формула дифракционной решётки будет иметь вид: . Так как sin(-α) = -sinα, из этой формулы при и получим или . Если свет распространяется не в воздухе, а в среде с показателем преломления n, то (λ – длина волны света в воздухе).

В этом случае предел разрешения запишется:

.

При другом подходе к выводу формулы для определения предела разрешения при наклонном падении лучей на объектив эта формула имеет вид: , где величину называют числовой апертурой.

Из этой формулы для Z следует, что одним из способов уменьшения предела разрешения является уменьшение длины волны света. В связи с этим применяется ультрафиолетовый микроскоп, в котором микрообъекты исследуются в УФ-свете. В нём используется оптика прозрачная для УФ-лучей (кварцевая оптика), а для фиксации изображения фотопластинка, люминесцентные экраны или электронно-оптические преобразователи.

Другой способ уменьшения предела разрешения – это увеличение числовой апертуры. Её можно увеличить, увеличив апертурный угол. Это можно сделать, приближая предмет к объективу. Однако расстояние предмета от линзы объектива не может изменяться произвольно, оно постоянно для каждого объектива.

Числовая апертура может быть увеличена с помощью специальной жидкой среды – иммерсии в пространстве между объективом и покровным стеклом микроскопа. В иммерсионных системах по сравнению с «сухими» системами получают большую числовую апертуру. В качестве иммерсионной среды используют воду (n=1,333), кедровое масло (n=1,515), монобромнафталин (n=1,66). При иммерсии свет от предмета до объектива проходит по оптически однородной среде и не даёт потерь на отражение. Это значительно повышает яркость изображения, что имеет весьма существенное значение, особенно для микроскопа с большим увеличением. В современных микроскопах апертурный угол может иметь наибольшее значение 70⁰. В этом случае предел разрешения оптического микроскопа 0,2 – 0,3 мкм.

Оценим полезное увеличение оптического микроскопа.

Если предмет имеет размер, равный пределу разрешения Z, а размер его изображения и, если его изображение расположено на расстоянии наилучшего зрения от глаз, то увеличение микроскопа:

.

Это увеличение называется полезным увеличением микроскопа.

Так как , то . Увеличение микроскопа названо полезным, потому что при нём глаз человека различает все элементы структуры объекта, которые разрешимы микроскопом.