Экзаменационный билет № 13

1(5). Материально-техническое обеспечение деятельности кдл. Расчет потребности в лабораторном оборудовании и реагентах.

2(35). Лабораторная диагностика ранних (гипогликемические и гипергликемические комы) и поздних (диабетическая нефропатия) осложнений сахарного диабета.

Постоянный контроль над уровнем глюкозы и поддержание ее концентрации в крови в физиологическом диапазоне существенно уменьшают риск развития осложнений сахарного диабета. Основная роль в патогенезе сосудистых ослож­нений сахарного диабета принадлежит гипергликемии, а при сахарном диабете 2 типа еще и нарушению липидного обмена.

Уровень гликемии при тяжелых осложнениях СД может быть различным, так, при кетоацидотической (кетоацидемической) коме он повышается до 16,55-19,42 ммоль/л, иногда достигая значений 33,3-55,5 ммоль/л. При этом глюкозурия, обычно соотв высокой конц глю в крови, сопровождается кетонемией и кетонурией. Реакция на ацетон в моче положительная. При гиперосмолярной (некетонемической) коме в плазме (сыворотке) крови выявляется необычно высокий уровень глю (более 33-44 ммоль/л), в моче определяется глю, реакция на ацетон отр или слабополож. Отмечается резкая гиперосмия плазмы, более 300 мосм/л, иногда до500, гипернатриемия, гиперхлоремия, гиперазотемия. Гиперлактацидемическая кома при СД сопровождается значительным повышением уровня молочной кислоты в крови и моче и менее выраженным – ПВК. Уровень гликемии незнач, нет кетонемии и кетонурии, реакция на ацетон отр. Гипергликемия вызывает присоед остатков глю к различным белкам: Нв, альбумину, белкам базальной мембраны (гликозилирование белков). Это приводит к изменению их свойств, повыш иммуногенности и развитию сосудистых поражений (микроангиопатии).

Осложнения сахарного диабета в виде комы: гипергликемической (mперосмолярной), кетоацидотической, гиперлактацидемической, гипогвикемической ..

Гипергликемическая кома наблюдается у 1­6% больных, госпитализироввнных ПО поводу сахарного диабета. Она может быть обусловлена прекращением или. уменьшением введения инсулина, несвоевременной диагностикой заболева­ния, првсоединением инфекционных болезней, хирурrическим вмешательством при неадекватном лечении диабета, а 'также стрессовыми ситуациями.

Клиническому проявлению диабетической комы обычно предшествует период декомпенсации сахарного диабета, выража­ющийся в пояиурии, полидипсии, уменьшении массы, анорек­сии, тошноте и рвоте; У детей и лиц молодого возраста прекома­тозное и коматозное состояния могут развиваться в течение не­скольких часов. При нарастании кетоацидоза усиливается рвота, полиурия и полидипсия, появляется запах ацетона в выдыхаемом воздухе,

Уровень глюкозы крови при диабетической коме повышен до 28 ммоль/л и более, однако иногда кома развивается при относи­тельно невысоком его содержании (14-16 ммояь/л). Уровень ке­тоновыхтел в крови повышен, увеличены содержание остаточного азота; мочевины,креатинина, свободных жирных кислот; со­матотропина, общего белка, гемоглобина, количество лейкоци­тов.

Гипогликемическая кома - ответная реакция организма на быстрое уменьшение утилизации глюкозы мозговой тканью. Ги­погликемическая кома может быть проявлением инсулиномы и диффузной гиперплазии бета-клеточного аппарата поджсщудоч­ной железы. Возникновению гипогликемической комы у боль­ных сахарным диабетом способствует почечная, печеночная, сер­дечная недостаточность, интенсивная мышечная нагрузка.

В начале комы возникают двигательное возбуждение, клони­ческие и тонические судороги, оглушенность, переходящая в со­пор. Уровень глюкозы в крови обычно понижен до 3-2,5 ммоль/л; кетоацидоз, как правило, отсутствует. Гипогликемическая кома может осложниться нарушением мозгового кровообра­щения, инсультом, гемиплегией. В случаях затянувшейся комы возможен летальный исход.

Начальные проявления гипогликемии легко устраняются пе­роральным введением углеводов. При выраженной гипоглике­мии внутривенно вводят 20-60 мл 40% раствора глюкозы, а подкожно - I мг глюкагона. Если этих мероприятий недостаточно для выведения больного из коматозного состояния, налаживают капельное введение 5-10% раствора глюкозы.

Ивсулинома (злокачественное опухолевое размножение бета­клетокостровков Лангерганса) у человека встречается редко и сопровождается повышенной выработкой инсулина, ЧТО ведет к снижению содержания глюкозы в крови и гипогликемическим припадкам, которые могут сопровождаться потерей сознания. Обычно проявляется гипогликемиейнатощак, при недоедании и интенсивной мышечной работе. При этом бывают чувство голо­да, угомление,беспокойство, недомогание, слабость, возможна потеря сознания. Приступы прекращаются после введения глю­козы.

Диабетическая нефропатия — общее понятие, которое включает диабетический гломерулосклероз, инфекции мочевыводящих путей и папиллярный некроз. Диабетическая нефропатия занимает первое место по частоте развития терминальной хронической почечной недостаточности, на втором месте — артериальная гипертензия и хронический гломерулонефрит.

Патогенез

Существует две теории развития диабетической нефропатии — иммунная и неиммунная. Согласно неиммунной теории, гипергликемия приводит к хронической гиперфильтрации и повышению скорости клубочковой фильтрации с последующим развитием внутриклубочковой гипертензии, повреждением и неферментативным гликозилированием гломерулярной базальной мембраны с потерей ею отрицательного заряда. В базальной мембране клубочков нарушается синтез гликозаминогликанов, повышается ее проницаемость для молекул белка, в результате чего возникает протеинурия.

Согласно иммунной теории, вырабатываются антитела к микросомам почечных клеток, инсулину крови, и образующиеся иммунные комплексы повреждают базальную мембрану почечных клубочков. Возможна и аутоиммунизация измененными детерминантами гломерулярных структур.

3(87). Оценка иммунного статуса, показания к назначению, особенности преданалитического этапа. Тесты 1-го и 2-го уровней. Принципы интерпретации результатов иммунограммы: Все методы диагностики состояния иммунной системы можно разделить на несколько групп. Некоторые методы выполняются врачом клинической практики, другие – специалистами в области инструментальной диагностики, третьи – специалистами лабораторного профиля. В силу разнообразия используемых методов диагностика состояния иммунной системы осуществляется на многоуровневой основе.

Иммунологические методы дают возможность исследования иммунного статуса – состояние иммунной системы человека в конкретный временной промежуток. Лабораторное исследование иммунного статуса – иммунограмма.

С учетом рациональности иммунодиагностики все лабораторные тесты принято организовывать в системе тестов двух уровней. Тесты 1 уровня позволяют установить выраженные изменения иммунного статуса, тесты 2 уровня способствуют изучению механизмов развития нарушений в иммунной системе. Соответственно тесты 1 и 2 уровня различаются по стоимости, специфичности, информативности, технологичности и другим параметрам.

Тесты 1 уровня (ориентирующие) включают:*определение количества лейкоцитов и лейкоцитарной формулы *определение субпопуляционного состава лимфоцитов переферической крови(СД3 для Т-лф,СД4 для Т-хелперов, СД8 для CTL, CД 19,20,21 для В-лф, СД56/16 для NK)*оценка фагоцитарной активности нейтрофилов с расчетом ФП и ФЧ *опредление основных классов сывороточных иммуноглобулинов (IgA, IgG, IgM) *определение функциональной активности системы комплемента.

После анализа результатов тестов 1 уровня определяют тактику дальнейшего исследования иммунного статуса. Тесты 2 уровня в отличие от тестов 1 уровнгя ставят избирательно в зависимости от того, какие цели преследует проводимое иммунологическое обследование.

Тесты 2 уровня включают:*опредление маркеров функциональной активности лимфоцитов, включая адгезивные молекулы, рецепторы к цитокинам, рецептор к трансферрину и др., в зависимости от показаний. *определение циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) *определение функциональной активности лф в тестах пролиферации, цитотоксичности, продукции цитокинов и др..*определение субклассов Ig и титра антигенспецифических антител. При показаниях определение IgЕ (общего и антигенспецифического). *определение миелопероксидазы и других ферментных систем фагоцитов, определение хемотаксической и адгезивной способности нф и др. функциональных параметров. * определение активности альтернативного пути активации комплемента, определение концентрации и функциональной активности отдельных компонентов.

При интерпритации иммунограмм: 1.комплексный анализ иммунограммы более информативен, чем оценка каждого показателя в отдельности. 2.Полноценный клинический анализ иммунограммы можно проводить лишь в комплексе с оценкой клинической картины и данных анамнеза 3.Реальную информацию об изменении иммунограммы несут лишь сильные сдвиги показателей (20-40% от нормы и более) 4.Анализ иммунограмм в динамике (особенно в сопоставлении с клин динамикой) более информативен с точки зрения как диакностики, так и прогноза течения зб 5. Для диагностической и прогностической оценки иммунограммы важнейшее значение имеют индивид показатели нормы у данного больного 6.Первостепенную практическию значимость при оценке иммунограммы имеют соотношения показателей иммунограммы, а не их абсолютное значение

Среди лабораторных методов, используемых в целях иммунодиагностики, особое место занимают:

1) методы, основанные на детектировании клеток и молекул иммунной системы с помощью маркированных моноклональных антител (МАТ). В основе этих методов – получение с помощью гибридомной технологии моноклональных антител к конкретным молекулам. Полученные моноклональные антитела маркируют флуорохромом, радиоактивным изотопом или иным способом и, используя основное свойство антител – способность связываться с антигеном, детектируют исследуемые молекулы на отдельных клетках, биопсийных образцах тканей или в других материалах. Для детекции связывания исследуемой молекулы с МАТ регистрацию результатов осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа, но эффективнее – с помощью проточного лазерного цитофлуориметра. Если МАТ маркированы радиоактивным изотопом, то результаты регистрируют с помощью счётчиков ионизирующего излучения, или с применением авторадиографии.

2) серологический метод. Этот метод также применяется на основе взаимодействия антиген-антитело, но в случае визуально детектируемого взаимодействия. Т.е. в тех случаях, когда взаимодействие антигена с антителом проходит как специфическую, так и неспецифическую фазу, формируя видимый невооружённым глазом макромолекулярный комплекс в виде агглютинатов или преципитатов (см. лекцию Антитела). Этот метод преимущественно используется для диагностики некоторых инфекционных заболеваний (для определения уровня антигенспецифических антител или антигенов возбудителя), для определения групп крови, а также для определения С-реактивного белка и некоторых других провоспалительных белков, циркулирующих в кровеносном русле в достаточно высокой концентрации.

3) молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция – ПЦР, метод молекулярной гибридизации с использованием ДНК-, РНК-зондов, реакция секвенирования). В основе этих методов - исследование отдельных генов, детекция мутаций. Молекулярно-генетические методы применяют для подтверждения первичных (врождённых) иммунодефицитов, для определения гаплотипа главного комплекса гистосовместимости при выявлении риска развития аутоиммунных процессов, для обнаружения в биологическом материале генома микроорганизмов и др.;

4) культурально-биологические методы. Это также большая группа методов, предполагающих применение в качестве вспомогательных реагентов клеток животных (эритроцитов барана, например), микроорганизмов (для определения фагоцитарной активности часто используются стафилококки, кандиды). Кроме этого в процессе проведения исследования применяется культивирование клеток иммунной системы в лабораторных условиях. Обычно эта группа методов применяется для оценки функциональной активности клеток иммунной системы.

Методы иммунологического анализа.

Методы клинико-иммунолгических исследований разделяются на методы оценки естественого клеточного и гуморального антигенспецифического иммунитета. Основной объект анализов – кровь (клеточные компоненты, сыворотка). Для выявления в периф крови Т- и В-лф исп-ся моноклональные антитела(МАТ). Для регистрации вз/д клетка–МАТ необходима метка (1.флуорохромы– иммунофлуоресцентный метод: производится учет клеток, имеющих кольцевое или точечное свечение на люминесцентном микроскопе или проточном цитометре. 2. ферменты – иммуноферментный анализ: для определения концентрации растворимых молекул).

∆Ранее состояние комплемента оценивали с использованием громоздкой гемолитической системы, позвол. получить суммарное представление об активности системы комплемента. В настоящее время доступно определение индивид. факторов комплемента методом ИФА с исользованием МАТ.

∆Оценка фагоцитирующих клеток (нейтрофилов), N 40-90%: опред. фагоцит. индекс и фагоцит. число; в качестве объекта фагоцитоза – St. aureus, зимозан, дрожжи, частицы латекса. ↑: восп процесс. ↓: хронизация воспал процесса и поддержание аутоиммунного процесса. *НСТ (нитросиний тетразоль добавляют к фагоцитирующим клеткам + объект →НСТ превращается в темно-синие гранулы (т.к. выраб активные формы кислорода) *Определяют адгезию клеток *Хемотаксис под агарозой. * Лизосомально-катионный тест 1,08-1,38 у.е. Хар-т степень активности кислороднезависимых микробицидных систем фагоцитв. Основан на цитохимическом выявлении неферментных лизосомально-катионных белков, относительное содержание которых в исследуемых клетках позволяет судить о представительстве названных антимикробных систем. ↑ при коллагенозах, аутоиммунном хр, вирусном гепатитах, циррозе печени.

∆Для определения активности NK-клеток используют: *определение их содержания в переферической крови с помощью иммунофенотипирования с СД16 и СД 56 (лимфоцитотоксический тест, иммунофлуоресценция, проточная цитофлуорометрия).*регистрация пролиферации под действием миним. концентрации зкзогенного ИЛ-2 в течение первых 12 часов культивирования. * определение цитотоксической активности NK по их способности лизировать клетки -мишени (инфицированные вирусами, опухолевые или аллогенные клетки). Чаще используют линии клеток миелоидного лейкоза К-562. Разновидности методов: 1. радиоизотопный с использованием меченого Cr⁵¹ уридина, рассчитывают количество лизированных клеток. 2. использование камер Перфильева.

В – клеточное звено иммунитета (г уморальный иммунитет)

Определение факторов гуморального иммунитета включает подсчет В-лф в переф. крови, определение концентрации Ig основных классов, а в особых случаях субклассов IgG. Адекватными тестами на В-лф является их цитофлуорометрическое определение с использованием ПАТ и МАТ к СД-19, 20, 21. Концентрацию Ig, а также типы легких цепей обычно опрделяют методом радиальной иммунодиффузии по Манчини с использованием поликлональных антител. Вособых случаях используют ИФА и МАТ.

∆Функциональную активность клеток определяют пролиферативные тесты: отражают способность различных популяций лф к вступлению в митотический цикл после воздействия индуктора (митогена), активатором для Т-лф является фитогемагглютинин (ФГА), для В-лф - бактериальный липополисахарид. Иногда клетки тестируют на сособность к ответу на митоген лаконоса(ответ осуществляют В-лф при участии Т-хелперов–индукция тимусзависимого гуморального ответа. При всех вариантах митогенной стимуляции регистрируется пролиферативный ответ клеток (радиометрически–по включению ³Н-тимидина) *МТТ-тест, МТТ добавляют в культуру живых клеток. Тест основан на изменении цвета красителя из синего в желтый. Регистрируют цитофотометрически. *использование цитофлуорометрической метки-йодида пропидия.

∆Оценка цитокинсинтезирующей и цитокинсекретирующей способности лф: учет результатов–ИФА либо по степени пролиферации клеток, размножение которых зависит от искомого цитокина

Новейшие методы: МНС-типирование, ПЦР.