3)70.Проточная цитометрия. Принципы, использование в иммунологической и гематологической практике.

Проточная цитометрия (ПЦ) представляет собой технику для быстрого оптического анализа отдельно взятых клеток. Методика заключается в выявлении рассеяния света лазерного луча при прохождении через него клетки в струе жидкости, причём, степень световой дисперсии позволяет получить представление о размерах и структуре клетки. Кроме того, в ходе анализа учитывается уровень флуоресценции химических соединений, входящих в состав клеточной стенки (аутофлуоресценция) или внесённых в образец перед проведением проточной цитометрии.

Это метод, в основу которого положено измерение характеристик клеток, их состовляющих, а также последующего физического отделения интересующей субпопупяции клеток или микрочастиц на основании анализа измеренных характеристик.

Уникальной особенностью многих клеток и частиц является их способность флуоресцировать. Проточная цитометрия основана на принципах возбуждения светом и эмиссии флуорохромных молекул. При помощи этого метода можно получать информацию о частицах и клетках размером от 0.5 до 4.0 мкм. Через проточные цитометры проходят гидродинамически сконцентрированные клетки, на которые воздействует источник света. В качестве источника света наиболее часто используют лазеры.

Как только на клетки или частицы попадает луч света, флуорохромы переходят на более высокий энергетический уровень. А возврат в исходное состояние происходит при помощи отдачи энергии в виде кванта света. Квант каждого флуорохрома имеет соответствующую длину волны. Испускаемый клетками и частицами свет регистрируется оптическими детекторами. Самым используемым в проточной цитометрии детектором является PMT (photomultiplier tube). Электрические импульсы, порождаемые световыми детекторами PMT-сенсоров, затем обрабатываются линейными и лаг-усилителями. Логарифмическое усиление наиболее часто используется для измерения флуоресцентной способности клеток. Этот тип усиления позволяет усилить слабые сигналы. После усиления сигналов и пульсов производится их обработка с помощью ADC (Analog to Digital Converter), который выводит конечный результат в виде гистограмм.

Методика обладает целым рядом преимуществ перед традиционной цитометрией, в числе которых:

• возможность исследования в ходе одного анализа значительно большего числа клеток (более 100000, тогда как микроскопия позволяет исследовать только несколько сотен клеток), что позволяет получать статистически достоверные результаты и выявлять редкие типы клеток;

• возможность проведения количественных измерений путем дифференцировки интенсивности рассеяния/флуоресценции при различных длинах волн;

• возможность одновременного исследования различных характеристик и структурных компонентов одной клетки.

Типичный аппарат для проведения проточной цитометрии позволяет определять до 5-10 различных параметров клетки, таких как размер, содержание белков, ДНК, липидов, антигенные свойства, активность ферментов и т.п. Кроме того, исследование отдельно взятых клеток даёт возможность выявить и оценить степень гетерогенности популяции, что не всегда может быть достигнуто другими методами.

В настоящее время проточная цитометрия применяется для выявления определённых клеток в исследуемых образцах (как бактериальных и грибковых, так и собственных клеток организма человека), определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, а также мониторирования состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Выявление бактериальных, грибковых, а также собственных клеток организма в биологических жидкостях крайне важно для диагностики многих заболеваний. В ходе одного из исследований было показано, что проточная цитометрия обладает в 100-1000 раз более высокой чувствительностью по сравнению с микроскопией и позволяет выявлять бактериальные клетки в количестве 10-100 в 1 мл крови. При более низкой концентрации бактерий в образце возможно проведение предварительной инкубации. Высокую чувствительность методу придает использование моноклональных антител, помеченных флуоресцирующим веществом (наиболее часто изотиоцианат).

Проточная цитометрия позволяет не только выявлять инфицирование микроорганизмами, но и определять спектр их чувствительности, причём, длительность исследования не превышает нескольких часов. Подвергнутые воздействию антибиотиков (in vivo или in vitro) микроорганизмы сравнивают с контрольными образцами того же штамма для установления их жизнеспособности, а также изменений в нуклеиновых кислотах, белках, оболочке клеток и т.п., что позволяет оценить как степень эффекта антибиотика, так и точку приложения его действия.

Ещё одной областью применения проточной цитометрии является мониторирование состояния вирусного процесса у ВИЧ-инфицированных лиц путём определения абсолютного количества CD4+ клеток и их доли в популяции лимфоцитов. Методика может также использоваться для контроля эффективности проводимой терапии.

Таким образом, проточная цитометрия обладает рядом преимуществ по сравнению с традиционными методами микробиологических исследований. Появление в последние годы в свободной продаже специальных наборов для выявления целого ряда микроорганизмов позволило значительно расширить диагностические возможности проточной цитометрии. Тем не менее, вопрос стандартизации метода и адекватной интерпретации его результатов остаётся актуальным до сих пор.