Экзаменационный билет № 21

1. Радиоиммунный анализ: принципы, виды, основные этапы исследования, приборы. Применение в КДЛ: Радиоиммунный анализ (РИА), также радиоиммунологический или изотопный иммунологический анализ, (англ. Radioimmunoassay, RIA) — метод количественного определения биологически активных веществ в биологических жидкостях, основанный на конкурентном связывании искомых стабильных и аналогичных им меченных радионуклидом веществ со специфическими связывающими системами (чаще всего с АТ), с последующей детекцией на специальных счетчиках — радиоспектрометрах.

Впервые метод был разработан Соломоном Берсоном и Розалин Сасмен Ялоу в 1950-х годах. С помощью этого метода они изучали клиренс инсулина у больных диабетом. Р. Ялоу получила за это Нобелевскую премию в 1977 году. Для метки антител или антигенов чаще всего используется изотоп йода ¹²⁵I , который имеет период полураспада 60 дней и высокую удельную радиоактивность.

В связи с тем, что меченый антиген добавляют в определенном количестве, можно определить часть вещества, которая связалась с антителами, и часть, оставшуюся несвязанной в результате конкуренции с выявляемым немеченым антигеном. Исследование выполняют in vitro. Для Р. а. выпускают стандартные наборы реагентов, каждый из которых предназначен для определения концентрации какого-либо одного вещества. Исследование проводят в несколько этапов: смешивают биологический материал с реагентами, инкубируют смесь в течение нескольких часов, разделяют свободное и связанное радиоактивное вещество, осуществляют радиометрию проб, рассчитывают результаты. Метод отличается высокой чувствительностью, его можно использовать в диагностике заболеваний сердечно-сосудистой, эндокринный и других систем, для установления причин бесплодия, нарушения развития плода, в онкологии для определения маркеров опухолей и контроля за эффективностью лечения, для определения концентрации в крови иммуноглобулинов, ферментов и лекарственных веществ. В ряде случаев исследования выполняют на фоне нагрузочных функциональных проб (например, определение содержания инсулина в сыворотке крови на фоне пробы на толерантность к глюкозе) либо в динамике (например, определение в крови половых гормонов на протяжении менструального цикла).

Радиоиммунный анализ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Так, например, с помощью коммерческого набора фирмы “ЭББОТТ” — Австрия II-I¹²⁵ удается выявлять HBsAg в концентрациях до 0,1 нг/мл. К преимуществам метода можно отнести возможность стандартизации и автоматизации метода с получением ответов в цифровом выражении. Недостатком метода являются ограничения, определяемые режимом работы с радиоактивным материалом, и относительно короткий срок годности диагностического набора, что связано с распадом радиоактивной метки.

Для подтверждения положительного результата, полученного при первичном скрининге образцов, рекомендуется повторное исследование РИА или в альтернативном тесте. При обнаружении HBsAg необходимо проводить конфирмационный тест.

2. Методы исследования системы микроциркуляторного гемостаза: принципы, аналитическая процедура, интерпретация: В зависимости от механизма остановки кровотечения принято различать два типа гемостаза: первичный и вторичный.

Первичный (микроциркуляторный, сосудисто-тромбоцитарный) гемостаз обеспечивает остановку кровотечения из мелких сосудов (венул, артериол, капилляров). При травме кровеносного сосуда первыми в реакцию остановки кровотечения вступают сосуды и тромбоциты. В первые минуты рефлекторно возникает спазм сосуда в месте повреждения, что значительно снижает кровопотерю. Сразу же вслед за сосудистым спазмом происходит адгезия (прилипание) тромбоцитов к краям поврежденного сосуда и их агрегация (склеивание) между собой. Освобождающиеся при этом из тромбоцитов АДФ (аденозиндифосфат), серотонин и адреналин усиливает сосудистый спазм и агрегацию тромбоцитов, а выделяющийся из поврежденных тканей и эндотелия сосудов тканевой тромбопластин взаимодействует с факторами плазмы (7, 4, 10, 5, 2), при этом образуется некоторое количество тромбина, в результате агрегация тромбоцитов становится необратимой, формируется первичный белый тромбоцитарный тромб, способный остановить кровотечение из микрососудов. При кровотечениях из более крупных сосудов тромбоцитарного тромба недостаточно для остановки кровотечения. Под мощным давлением крови такой тромб распадается и кровотечение продолжается, поэтому для окончательной остановки его подключаются механизмы вторичного, коагуляционного гемостаза.

Для оценки первичного сосудисто-тромбоцитарного гемостаза опредляют:

1. Количество тромбоцитов и их функциональные свойства (адгезия, агрегация, исследование уровня тромбобоцитарных факторов.

2. Время капиллярного кровотечения по Дюке (прокол кожи скарификатором, N 2-4 мин, макс 5 мин.), Айви и др.

3. Проба на резистентность сосудистой стенки (пробы щипка, манжеточная, жгута) и др.

Методы исследования первичного гемостаза.

Определение длительности капиллярного кровотечения по Дюке.

Определяется длительность кровотечения из капилляров кожи после прокола кожи скарификатором. Норма: продолжительность кровотечения составляет 2-4 мин, максимум 5 мин. Тест удлиняется при выраженных тромбоцитопениях, болезни Виллебранда, а также при зб печени, гипивитаминозе С, злокач опухолях, интоксикациях и др. При гемофилиях чаще этот тест остается в норме.

Агрегация тромбоцитов. Исследуется на агрегометре «СОЛАР» или приборе другого типа. После добавления к плазме, богатой тромбоцитами, веществ, вызывающих агрегацию (раствор АДФ, адреналин, ристомицина и др.), проводят запись агрегатограммы, прибор дает характеристику степени агрегации, времени и скорости агрегации. Гиперагрегация тромбоцитов как при макс, так и субпороговых дозах агрегирующих веществ характерна для предтромботических и тромботических состояниях (нарушение коронарного и мозгового кровообращения, атеросклероз, ГБ, сах диабет, гиперлипидемии и др.). Усиленная агрегация тромбоцитов нередко явл первым этапом внутрисосудистого тромбообразования и может служить критерием риска развития тромбоза. Сниженная агрегация тромбоцитов наблюдается при различных видах качественной неполноценносит и дисфункциях тромбоцитов. Эти нарушения могут быть как наследственного (болезнь Гланцмана, Виллебранда и др.), так и приоберетенного характера (болезни печени, почек, зб крови).

Метод Айви.

Определяют время кровотечения при повышенном венозном давлении (до 49-50 мм рт ст тонометром), на ладонной поверхности – три прокола, вкл секундомер, капли крови промокают через 15-30 сек. Норма длительности кровотечения по Айви – 1-7 мин. КДЗ такое же как при предыдущих тестах. На следующий день корочки снимают – кровотечение должно быть короче первого.

Все эти тесты говорят либо о нарушении в сосудистой стенке, либо о качестве тромбоцитов.

К первичному гемостазу еще: проба на резистентность сосудистой стенки (проба щипка, манжеты) – недостаток аскорбиновой кислоты, рутина, деф железа.

Названия факторов:

I – фибриноген ( это гликопротеин, синтезируется в печени, относится к белкам острой фазы воспаления и к репаративным белкам, в норме в плазме содержится 2-4 г/л, в сыворотке не содержится, под влиянием тромбина фибриноген превращается в в фибрин, проходя 3 стадии: это 3 стадии процесса свертывания: 1) от молекулы фибриногена отщепляются фибринопептиды А и В, 2) оставшиеся фибриномономеры соединяются друг с другом в полимер, образуется промежуточный, растворимый фибрин, фибрин-S, 3) под влиянием активной фибриназы (8а) образуются дополнительные связи между полипептидными гамма-цепями и фирин- S превращается в нерастворимый фибрин-1.

II – протромбин (также гликопротеин, при электрофорезе белков передвигается с альфа-глобулинами. Синтезируется в гепатоцитах при обязательном наличии витамина К, поэтому протромбин относится к К-витаминзависимым факторам. В сыворотке крови не содержится, в процессе свертывания превращается в активный фактор тромбин (вторая фаза процесса свертывания крови).

III – тканевой тромбопластин (фосфолипид с высокой молекулярной массой. В плазме крови не содержится, а содержится во всех клетках организма, особенно в сером веществе головного мозга, легких, печени, предстательной железе, матке, околоплодных водах, эндотелии сосудов и др. При повреждении тканей создаются условия поступления его в кровь данного фактора, он взаимодействует с 7 плазменным фактором и ионами кальция, активирует 10 плазменный фактор, который вместе с 3 тромбоцитарным и 5 факторами образует активную тканевую протромбиназу. Т.о свертывание крови запускается по внешнему механизму. В лаборатории этот механизм демонстрируется протромбиновым временем.

IV– ионы кальция (участвуют во всех фазах процесса свертывания крови, они необходимы для 1-й, 2-й, 3-й фаз. Содержатся как в плазме, так и в сыворотке крови, получение плазмы для коагулограммы основано на ингибировании ионов кальция антикоагулянтом – лимоннокислым натрием).

V, VI – проакцеллерин (лабильный), акцеллерин (проакцеллерин синтезируется в печени, относится к бэта-глобулинам, мало стоек при хранении плазмы. В комплексе с 10 фактором значительно ускоряет превращение протромбина в тромбин. Акцеллерин – это активный 5 плазменный фактор.)

VII – проконвертин (стабильный) (гликопротеин, стабильный фактор, сохраняется в сыворотке и плазме, явл центральным фактором во внешнем механизме активации процесса свертывания, синтезируется в печени и явл К-витаминозависимым фактором).

VIII– антигемофильный глобулин А (участвует в образовании активной кровяной протромбиназы, 1- й фазы процесса свертывания, синтезируется, возможно, в печени, селезенке, лимфоцитах, не сохраняется в плазме крови при ее хранении. При его дефиците развивается классическая гемофилия А.

IX – Кристмасс-фактор, плазменный тромбопластиновый (антигемофильный глобулин В, участвует в 1 фазе, синтез – в печени, К-витаминозависимый фактор, в отличие от 8 фактора сохраняется в плазме и в сыворотке крови. При его дефиците развивается гемофилия В.

X - фактор Стюарта-Прауэра (гликопротеин,составляющий основу активной протромбиназы, синтез – в печени, при наличии вит К.

XI – фактор Розенталя, плазменный предшественник тромбопластина, антигемофильный фактор С (гликопротеин, участвует в 1-ой фазе процесса свертывания крови, при его дефиците развивается гемофилия С.

XII – фактор Хагемана, фактор контакта (гликопротеин, явл инициатором начала процесса свертывания крови про внутреннему мех-му. Этот фактор может активироваться внутри организма воспалительным процессом, повреждением тканей, сосудов, иммунными комплексами, жирными кислотами, адреналином и т.д, а вне организма активируется при соприкосновении крови с чужеродной поверхностью: металл, стекла, каолин.

XIII – фибриназа, фибринстабилизирующий фактор (принимает участие в 3-ей фазе процесса свертывания крови, оказывая влияние на прочность сгустка. При его недостаточности фибриновый сгусток непрочный, возможны повторные кровотечения).

Дополнительные факторы – фактор Виллебранда (8.фВ-8.АГ)

Фактор Флетчера (прекалликреин)

Фактор Фитцжеральда (кининоген)

Наряду с плазменными факторами в остановке кровотечения участвуют тромбоцитарные, эритроцитарные и лейкоцитарные факторы.

Процесс свертывания крови протекает в несколько этапов (фаз), которые условно делят на 4 фазы: протромбинообразование, тромбинообразование, фибринообразование, посткоагуляционная фаза (ретракция и лизис сгустка). Это вторичный гемостаз.

Первая фаза процесса сверывания крови – образование протромбиназы. 4-6 мин. Реакции, характерные для этой фазы, могут развиваться как по внутреннему (через XII активный фактор), так и по внешнему механизму (через активный тромбопластин).

В процессе первой фазы кровь сохраняет жидкую консистенцию.

Вторая фаза свертывания крови – образование тромбина. Протромбиназа превращает протромбин (IIфактор) в тромбин (активный II фактор – IIа). В этой реакции принимают участие V, VII, X (плазменные факторы протромбинового комплексов) и первый тромбоцитарный факторы, продолжительность этой фазы составляет короткий промежуток времени – 2-5 сек. Кровь продолжает сохранять жидкую консистенцию.

Третья фаза свертывания крови – образование фибрина. Тромбин (IIа), воздействуя на фибриноген (1), переводит его в фибрин-мономер. Последний, полимеризуясь, образует вначале растворимый фибрин-полимер (фибрин S), который под влиянием фибриназы (8 плазменный фактор) переходит в нерастворимый фибрин (фибрин I ). Нерастворимый фибрин выпадает из плазмы в виде бесцветных переплетающихся нитей, которые как сеть увлекают с собой форменные элементы крови. Поэтому фибриновый сгусток всегда окрашен в красный цвет за счет эритроцитов. Продолжительность этой фазы занимает 3-5 секунд. Кровь теряет жидкую консистенцию, состояние ее гелеобразное, образуется фибриновый сгусток.

Посткоагуляционная фаза – ретракция и фибринолиз. Образовавшийся сгусток фибрина (фракция 1) сокращается (ретрагирует) (под влиянием 8 тромбоцитарного фактора – ретрактозима) при 37 градусах в течении 2 часов после свертывания крови на 60-80%, при этом выделяется сыворотка (фракция 2. Одновременно сгусток подвергается растворению (фибринолизу), в результате чего из сгустка выпадает часть форменный элементов (фракция 3).

Система антикоагулянтов. Каждой фазе процесса свертывания крови препятствует противосвертывающие вещества – атикоагулянты. Они бывают первичные, постоянно синтезируемые в организме и присутствующие в кровотоке, и вторичные, которые образуются только в процессе свертывания крови, протеолиза, фибринолиза. Первичные антикоагулянты взаимодействуют только с активными факторами свертывания крови и, кроме того, принимают участие в других процессах, протекающих в организме.

Наиболее выраженным антикоагулянтным действием обладает антитромбин III. Этот белок синтезируется в печени и относится к первичным антикоагулянтам, он обеспечивает до 90% всей антикоагулянтной активность крови. Действие антитромбина III проявляется совместно с гепарином (антитромбином II). Гепарин с антитромбином III обеспечивают жидкое состояние крови.

Среди вторичных антикоагулянтов выделяют фибрин, который сорбирует на себе тромбин и переводит его в неактивное состояние – метатромбин. В эту группу относят также продукты расщепления фибриногена и фибрина, нарушающие полимеризацию фибрин-мономеров и блокирующие молекулу фибриногена, делая ее недоступной для активации тромбином.

Система фибринолиза (плазминовая система) представлена основным белком плазминогеном, активаторами плазминогена и антиплазминами. Плазмин вызывает расщепление фибрина на отдельные фрагменты – продукты деградации фибрина (ПДФ-ина), которые затем удаляются из кровотока. При патологии (повыш активности фибринолиза) плазмин расщепляет не только фибрин, но также и фибриноген, с образ продуктов деградации фибриногена (ПДФ-гена), и другие плазменные факторы (II, VIII, IX и т д). Естественными ингибиторами плазмина являются антиплазмины. С лечебной целью используют ингибиторы плазмина: контрикал, трассилол, аминокапроновую кислоту.

3. Лабораторные алгоритмы диагностики врожденных и приобретенных иммунодефицитов: Иммунодефицит-состояние недостаточности функции иммунной системы вследствие резкого снижения или полного отсутствия какого-либо типа молекул или клеток иммунной системы.

Для диагностики иммунодефицитов применяют гематологические, биохимические, молекулярно-генетические и иммунологические методы. Иммунологические методы дают возможность исследования иммунного статуса. Под иммунным статусом понимают состояние иммунной системы человека в конкретный временной промежуток. Собственно лабораторное исследование иммунного статуса называют иммунограммой.

Лабораторная диагностика ИДС включает следующие основные методы:

• определение абсолютного и относительного количества популяций и субпопуляций В- и Т-лимфоцитов с помощью иммунофенотипирования (см.лаб.занятие 3);

• определение функциональной активности иммунокомпетентных клеток с помощью пролиферативных тестов (см. лаб.занятие 4), определения цитокинпродуцирующей активности клеток, определения миграционной активности клеток, определения цитотоксический активности клеток.

• определение сывороточных, секреторных Ig их классов (см. лаб.занятие 5), субклассов;

• оценку состояния фагоцитов (см. лаб.занятие 1), включая определение достаточности их факторов бактерицидности и других функциональных параметров (адгезия, хемотаксис);

• определение компонентов комплемента.

С учетом рациональности иммунодиагностики все лабораторные тесты принято организовывать в системе тестов двух уровней. Тесты 1 уровня позволяют установить выраженные изменения иммунного статуса, тогда как тесты 2 уровня способствуют изучению механизмов развития нарушений в иммунной системе. Соответственно, тесты 1 и 2 уровней различаются по стоимости, специфичности информации, технологичности и другим параметрам.