Экзаменационный билет № 24

1. Полимеразная цепная реакция: аналитическая процедура, приборы, клиническое применение. ПЦР в режиме реального времени: ПЦР-метод, имитир естеств репликю ДНК и позвол обнаруж единств специфю моллу ДНК в присут млн др молл,эксперим мд мол биол, позвол добиться значит увеля малых концй опредх фрагмв нк в пробе.1983 Kary Mullis Суть:амплифя в пробке опредх ув ДНК в проц повторся темперх циклов.СХЕМА:Реакцисмесь содерж матрич ДНК,4 дезоксири-бонуклеозидтрифосфата dATP, dCTP, dGTP и ТТР, Taq-полиме-разу(выдел из термофиловthermos_acquaticus,+Mg)и2синтетических_олигодезоксирибонуклеотид праймера длиной 15-30 нуклеотидов, комплементх учм противополх цепей ДНК, фланкирующих исследй учк ДНК-матрицы. ПЦР начин с кратковрем (1-2 мин) прогревя реакц смеси при ~95°С: плавление цепей ДНК и инактивя примесных бв-> реакц смесь охлажд до t отжига праймеров с матрич ДНК (37-65°С). В рез праймеры связся с комплементми местами на матрице и служат затравками д\сза Taq-полимеразой новых цепей ДНК, комплементх каждой из цепей денатурий матрич ДНК. Д\провед сза ДНК в оптим д\Taq-ползы услх тру реакц смеси подним до 72°С и проводят элонгацию=синтез цепей вновь синтезирся ДНК в теч 0,5-2 мин. По оконч стадии сза ДНК заканчся 1й цикл ПЦР->2й,3й..в автомат режиме. После заверш 3 цикла обрся дискрет продукт ПЦР - фрагмент дцДНК, содержй на своих 5'-концах последти нуклеотв праймеров. Кво прода ПЦР в реакц смеси после заверш кажд цикла удваив и по мере прохя ри экспоненц возраст- неск микрограммов в реакц смеси V 25-50 мкл. В финале содерже реакц смеси анализт с пом электроф в агароз геле в при бромистого этидия, где продт ри выявся в УФ-свете. можно выдел из агар геля в чист виде и работать с ним как с обычн фрагмем дцДНК, т.е. гидролизовать рестриктазами, клонирть в плазмидх векторах по липким и тупым концам, секвенирть или испть в кач зондов при гибриди.. длина 0,1--5-7 т.п.о. амплификатор — прибор, обесп периодич охлажде и нагреве пробк.Д\ПЦР в реал врем выпуск приборы, оборуде флуоресц детектором. 3стади:Денатурация 94—96°C,Отжиг. Элонгация (синтез)… Эффект плато-огранич рост накопления..Мультипраймерная ПЦР-процесс коамплифики нескольк ДИК-мат­риц в одной реакц среде с использ неск пар прай­меров.. Гнезд ПЦРд\рнк,тк Таq-полза не способ каталть сз ДИК на матрице РНК--РнК-завис ДнК полза- обрат транскриптаза. Ря, каталя этим фм, приводит к обр од­нонитх фрагмв ДНК, испх в амплифи с пом Таg-полимеразы. in Situ ПЦР- внутри кл - ранняя диагн инф забол у серонегативных пациентов,- выявл персистирх, латент и рецидивир форм инфй; - контроль проведя лечя; - диагнка оппортунист инфй, протек на фоне иммунодеф,-уточнение сомнит резв серолог исслй;-эпидемиол исследя;- выявл наиболее патоген штаммов инф агентов;-иссля инфти пулированных образцов крови и ее продв, применх в клинике;-опред резистти к лв.-пренат диагн наслед забол (муковисцидоза, фенилкетонурии, гемофилии и пр.), а также при установлении отцовства.

2. Лабораторная диагностика наследственных гемолитических анемий: Наследственные гемолитические анемии делятся на три большие группы