2(65). Интерпретация результатов исследования мокроты.

Бронхит. При остром серозном или катаральном бронхите мокрота имеет слизисто-гнойный, гнойно-слизистый или гной­ный характер. Цвет ее в зависимости от характера может быть желтовато-серым, серовато-желтым или желтым. Консистенция мокроты чаще всего тягучая или студенистая, но может быть и вязкой из-за примеси гноя. При микроскопическом исследова­нии обнаруживается небольшое количество лейкоцитов, могут быть эритроциты. Клетки эпителия бронхов встречаются в зна­чительном количестве, в виде скоплений, пластов. При ката­рально-гнойном бронхите клеток эпителия меньше, чем при ка­таральном. При гнойном бронхите они единичные. При аллер­гическом бронхите в мокроте можно обнаружить эозинофилы, спирали Куршмана, кристаллы Шарко-Лейдена. Характер мокроты при хроническом бронхите зависит от ста­дии заболения. На ранних стадиях мокрота обычно слизистая, при обострениях слизисто-гнойная или гнойная.

Бронхиальная астма. В основе этого заболевания лежит об­струкция бронхов, которая обусловлена действием аллергена и характеризуется сокращением мускулатуры бронхов (бронхо­спазмом), набуханием слизистой оболочки бронхов, закупоркой просвета бронхов вязкой слизью. Мокрота выделяется во время приступа. скудная, слизистая, вязкая, стекловидная, бесцветная, отделяется с трудом. При микроскопии выявляется большое ко­личество эозинофилов, иногда распадающихся, кристаллы Шар­ко - Лейдена, спирали Куршмана, небольшое количество эрит­роцитов. Количество лейкоцитов может быть различным в зави­симости от выраженности воспалительного процесса. Клетки эпителия бронхов располагаются разрозненно в виде скоплений, иногда с признакам и жировой дистрофии. Пневмония - это воспаление легочной паренхимы. Боль­шинство пневмоний имеет инфекционное происхождение, но могут встречаться аллергические и химические пневмонии. Воз­будителями пневмонии бывают пневмококк, стрептококк, гное­родные стафилококки.

Острая пневмония характеризуется глубокими изменениями в функции всего бронхо-легочного аппарата. При остром серозном воспалении выделяется густая, тягучая слизистая мокрота, затем слизисто-гнойная, часто с красноватым или буроватым оттенком, отходит с трудом. Симптом «ржавой» мокроты характерен для крупозной пневмонии. При микроско­пическом исследовании в мокроте можно выявить эритроциты, альвеолярные эпителиоциты в состоянии жировой дистрофии, макрофаги, лейкоциты, эпителий бронхов, нити фибрина. Позже в мокроте увеличивается количество лейкоцитов, которые под­вергаются жировой дистрофии и частично распадаются, образуя детрит. В период разрешения увеличивается количество макро­фагов. Вследствие распада лейкоцитов и освобождения протео­литических ферментов мокрота приобретает вид гнойной массы. В дальнейшем количество лейкоцитов уменьшается, появляются альвеолярные эпителиоциты, гистиоциты. Мокрота при стафилококковых пневмониях слизисто-гной­ная или гнойная, может содержать эритроциты. Если участки пневмонии подвергаются распаду с образованием полостей, аб­сцессов различной величины, то мокрота может содержать элас­тические волокна.

Бронхопневмония характеризуется началом воспалительного процесса в бронхах с переходом на легочную ткань. Обычно мокрота гнойно­слизистая или слизисто-гнойная. Эпителий бронхов в начале заболевания встречается в виде скоплений и пластов, но по мере развития воспалительного процесса его количество уменьшается. Много альвеолярных макрофагов с жировой дистрофией, много лейкоцитов.

Воспаление легких при гриппе представляет собой катараль­ную бронхопневмонию, иногда геморрагического характера. Со­ответственно мокрота бывает гнойно-слизистая или кровянистая.

Хроническая пневмония. Выделение мокроты зависит от стадии и фазы заболевания. В период обострения количество ее увели­чивается; она слизисто-гнойная с прожилками крови. В период ре­миссии количество мокроты уменьшается, она может быть слизистой, количество нейтрофилов уменьшается, преобладают клетки ци­линдрического эпителия, макрофаги, метаплазированный эпителий.

Абсцесс легкого обычно возникает как осложнение пневмо­нии, но гнойник в легком может образоваться при заносе гное­родной инфекции; гемато-, бронхо-, лимфогенным или травма­тическим путем. Характер мокроты может быть различным в за­висимости от локализации процесса, его распространенности и периода заболевания. В раннем периоде изолированного абсцес­са мокрота может быть скудная. При прорыве в бронх обшир­ного абсцесса легкого внезапно выделяется значительное коли­чество (200-600 мл) мокроты. При стоянии она расслаивается на два слоя: верхний - слизисто-гнойный, серозный и нижний ­гнойный, густой, зеленоватый с мелкими обрывками ткани лег­кого. При микроскопическом исследовании мокроты обнаружи­вают большое количество лейкоцитов, частично распадающихся и образующих детрит, эритроциты в разном количестве, фибрин. Часто обнаруживаются эластические волокна, что является дока­зательством деструкции ткани легкого. Находят кристаллы гема­тоидина, иглы жирных кислот, микробную флору.

Гангрена легкого. Мокрота выделяется в большом количестве, чаще жидкая, серовато-буроватого цвета с примесью крови, с резким гнилостным запахом. При стоянии расслаивается на три слоя. При микроскопическом исследовании выявляются большое количество лейкоцитов в состоянии распада, кристаллы жирных кислот, эластические волокна, кристаллы гематоидина.

Бронхоэктатическая болезнь развивается как следствие хрони­ческой пневмонии в результате расширения средних бронхов и бронхиол, в которых нет хрящевой прослойки. Мокрота выделя­ется в большом количестве утром, чаще всего гнойного характе­ра, зеленоватого или серого цвета, иногда с примесью крови. Содержимое бронхоэктазов под воздействием микроорганизмов может подвергаться гниению, тогда мокрота приобретает гни­лостный запах за счет индола. аммиака, жирных кислот. Эластических волокон, в отличие от случаев абсцесса и гангрены лег­кого, не содержит.

Туберкулез легких - это инфекционное, в основном хрониче­ское, заболевание, вызываемое микобактериями туберкулеза. Характер мокроты при туберкулезе зависит от тече­ния процесса. В начальной стадии мокроты мало, она слизистая, вяз­кая, с примесью отдельных гнойных комочков. Микобактерии мо­гут не определяться, лейкоцитов и альвеолярного эпителия мало. Постепенно мокрота становится обильной, слизисто-гнойной, нередко с примесью крови, могут быть эластические волокна, фибрин, микобактерии, металлизированный эпителий. В поздних стадиях, с образованием каверн, в мокроте выявляют коралловид­ные волокна, обызвествленные эластические волокна, обызвеств­ленный казеозный распад (крошковатые беловатые массы), кри­сталлы холестерина, микобактерии туберкулеза (тетрада Эрлиха).

Частота, массивность и постоянство бацилловыделения зави­сят от формы туберкулезного процесса. Чаще микобактерии ту­беркулеза выявляются при деструктивных формах туберкулеза, реже при диссеминированной форме.

Рак легкого характеризуется большим разнообразием гисто­логического строения.

В мокроте обнаруживаются клеточные элементы рака легкого, смешанные со слизью, гноем, кровью. Характер клеток и их со­четания, встречаемые в мокроте при раке легких, зависят от гис­тологической структуры опухоли.

При раке легкого не выделяется какая-либо типичная по сво­ему виду и характеру мокрота. Элементы опухоли можно обна­ружить в слизистой, слизисто-гнойной, гнойной мокроте без ви­димой примеси крови, а также с различным ее содержанием. Косвенные данные, которые настораживают в отношении рака, ­это эластические волокна, кристаллы холестерина, жирнозерни­стые клетки. Наличие эластических волокон свидетельствует о некрозе ткани, который может быть связан с патологическим процессом различного происхождения. Чаще всего это туберку­лез, гангрена, новообразования легких. О раке легкого можно думать только при обнаружении комплексов атипичных клеток с признакам и злокачественности: с резким полиморфизмом вели­чины и формы клеток, с нарушениями ядерно-цитоплазмати­ческого соотношения в сторону увеличения ядра, с наличием в ядрах множественных неправильной формы нуклеол с гиперхромией и неравномерным расположением хроматина ядер, ба­зофилией цитоплазмы и наличием митозов и амитозов, клеток с химической анаплазией и с другими признаками. Для подтверждения диагноза необходимо ис­кать комплексы клеток с перечисленными признаками, что свя­зано с необходимостью изучения большого числа препаратов. Цитологическая диагностика опухолей требует специальной подготовки.

3(98). Общие принципы диагностики вирусных инфекций. Вирусологические, серологические и экспресс-методы: Диагностика инфекционного заболевания подразумевает, как минимум, два компонента - 1) идентификацию возбудителя и 2) реакцию организма на инфекционный процесс.

Вопросы, связанные с обнаружением возбудителя болезни, его идентификацией, определением его лекарственной чувствительности, с исследованием источника заражения и путей передачи инфекционного заболевания решаются в процессе микробиологической диагностики. Степень поражения организма инфекционным агентом, уровень поддержания гомеостаза, выраженность компенсаторно-адаптационных реакций, в свою очередь, определяются на основе исследований клеточного состава крови (гематологических анализов), исследований биохимических параметров, параметров иммунного статуса и проч.

Серологический	позволяет обнаружить и идентифицировать антигены микроорганизмов и антитела к ним, появляющиеся в процессе инфекционного заболевания. Эффективность метода зависит не столько от свойств возбудителя, сколько от иммунологической реактивности пациента (есть серонегативные случаи). Часто отличается ретроспективностью
Молекулярно-биологический (ПЦР и др)	позволяет провести идентификацию генома возбудителя

Диагностика инфекционных болезней, связанная с определением серологических маркеров (Аг и Ат)

Серологический метод представляет собой совокупность реакций, основанных на взаимодействии антиген-антитело (см.) и направленных на выявление в сыворотке крови и других жидкостях организма антител к антигенам возбудителей инфекционных болезней, либо собственно микробных антигенов. Серологический метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью. Большинство реакций этого метода просты в проведении и учете, доступны широкому кругу лабораторий, как правило, безопасны, экономичны, поддаются стандартизации. К недостаткам серологического метода можно отнести: 1) косвенный характер результата, когда об этиологии болезни судят не по выделению возбудителя, а по ответу (иммунному) организма на возбудитель; 2) необходимость парентерального вмешательства в организм больного; 3) в большинстве случаев позднюю постановку диагноза, что объясняется природной динамикой гуморального иммунного ответа; 4) возможность принять анамнестические Ат (как результат ранее перенесенного заболевания или вакцинации) за Ат к текущей инфекции. При определении микробных антигенов 3-й и 4-й недостатки отсутствуют, но необходимо учитывать особенности циркуляции антигенов разных микробов и соотносить эти особенности с возможностью взятия материала для исследования.

Этапы серологического метода:

1) взятие материалов для исследования. В большинстве случаев материалом является сыворотка крови. Ее получают после образования сгустка крови, кровь следует забирать в строго асептических условиях по стандартной методике. Сыворотку крови относительно долго можно хранить в замороженном состоянии. При некоторых заболеваниях материалом для исследования могут служить ликвор, моча, фильтрат испражнений, промывные воды бронхов, полости рта, глотки, носа,

2) выбор серологической реакции для данного случая зависит от цели исследования, предполагаемого заболевания, фазы болезни, материала для исследования, чувствительности реакции, возможностей конкретной лаборатории. Для выявления Ат, а также Аг используют реакции агглютинации (РА), пассивной гемагглютинации (РПГА)), иммунофлюоресценции (РИФ), торможения гемагглютинации (РТГА), преципитации, флоккуляции, реакцию связывания комплемента (РСК) и др.

3) постановка серологической реакции,

4) регистрация серологической реакции с целью определения присутствия серологических маркеров инфекции.

Разнообразным серологическим реакциям свойственно несколько общих характеристик:

1) так как любые серологические реакции являются реакциями взаимодействия Ат и Аг, то во всех случаях для установления присутствия Ат в исследуемом субстрате необходим набор известных стандартных корпускулярных или растворимых Аг, называемых диагностикумами. В свою очередь, для установления присутствия Аг нужен набор иммунных диагностических сывороток,

2) взаимодействие Аг и Ат осуществляется только в присутствии электролита, в качестве которого обычно используют изотонический раствор хлорида натрия или буферные смеси, рН системы должен быть около 7,

3) для образования комплекса Аг-Ат требуется период инкубации при особых температурных условиях (от +4 °С до 37 °С). Образование специфического иммунного комплекса происходит быстро; видимого простым глазом феномена (агглютинации, лизиса и др.) - медленно, через несколько часов или даже суток,

4) оба компонента серологической реакции (антиген и антитела) должны присутствовать в эквивалентном соотношении. Избыток какого-либо из компонентов блокирует образование комплекса Аг-Ат и способствует ложно отрицательным результатам.

В процессе оценки серологического метода часто возникает необходимость отличить специфическую реакцию (на видовые и типовые Аг) от группоспецифической (на межвидовые Аг) и иммунный ответ на текущую инфекцию - от иммунного ответа на перенесенное ранее заболевание и иммунизацию. В первом случае дифференциация основывается на использовании монодиагностикумов, скорости нарастания титра Ат, которая выше к специфическим Аг, реакции адсорбции Ат избытком Аг, легкости диссоциации иммунного комплекса под влиянием диссоциирующих факторов. Во втором случае для дифференциации применяют темпы нарастания титра Ат, которые выше при текущей инфекции, особенности проявления реакции и классов Ig, сопоставление результатов серологического метода с бактериологическими и клиническими данными.

Учет серологических реакций осуществляют визуально, иногда с помощью лупы. Суть учета серологической реакции сводится к определению феномена связывания Аг и Ат по образованию комплекса Аг-Ат. Визуально образование комплекса Аг-Ат сопровождается двумя основным феноменами - агглютинацией и преципитацией. Различия между ними определяются особенностями антигенов и антител, специфичных к ним. В то же время, среди микробных антигенов присутствуют и такие, которые индуцируют синтез непреципитирующих, образование комплекса Аг-Ат в данном случае не сопровождается ни феноменом агглютинации, ни феноменом преципитации, а выявление факта образования комплекса Аг-Ат требует маркирования диагностического компонента реакции специальными метками, либо перевода диагностического антигена в другое агрегатное состояние

При оценке реакции применяют 3 главных критерия: 1) наличие и интенсивность реакции (в плюсах и др.); 2) диагностический титр, 3) нарастание титра Ат в течение болезни в 4 раза и более. Наличие реакции устанавливают по визуальным феноменам или по связыванию иммунохимического маркера. Для оценки интенсивности серологической реакции используют принцип 4 "+".

Особый вопрос заключается в количественном выражении результатов серологической реакции, так как диагностика инфекционных болезней предполагает не только определение факта присутствия антител (антитела могут быть не только маркером протекающего инфекционного заболевания, но и - поствакцинального иммунитета, либо маркером перенесенного в прошлом заболевания), но и определение их количества. С этой точки зрения в настоящее время присутствует две равноправные возможности. Первая возможность касается непосредственного определения количества антигенспецифических антител, выражаемого в системе г/л. Для такого определения тест-система для постановки серологической реакции должна иметь специальный образец-стандарт с уже известным содержанием антигенспецифических антител. Этот стандарт используется для

построения калибровочного графика. Но в силу технологических проблем при приготовлении стандартов данный подход используется лишь в ограниченном числе тест-систем. Чаще применяют вторую возможность - определение количества Ат в виде титра. Для определения тира Ат (или титра Аг) необходимо поставить серологическую реакцию, приготовив ряд разведений сыворотки крови или иного материала (раститровать). При приготовлении разведений сыворотки крови используют раствор электролита (чаще всего изотонической раствор хлорида натрия).

Диагностический титр - это титр антител, характерный для большинства случаев конкретного инфекционного заболевания, определяемый на пике гуморального иммунного ответа. Диагностический титр определяется путем многочисленных исследований, выполняемых на базах различных лабораторий.

В то же время, есть ряд ситуаций, когда подтверждение диагноза инфекционного заболевания с помощью диагностического титра невозможно: 1) если определение титра антител осуществляется ранее, чем развивается гуморальный иммунный ответ, то, естественно, титр антител будет ниже диагностического, 2) при перенесении заболевания или после вакцинации в прошлом (в анамнезе), 3) при инфекциях, вызванных условно-патогенными микробами, в частности представителями нормальной микрофлоры. В этих случаях для подтверждения диагноза инфекционной болезни используется понятие "нарастание титра антител", т.е. оценивается динамика гуморального иммунного ответа. Критерием развития гуморального иммунного ответа является нарастание титра антител за 10 - 14 дней в 4 и более раз. Соответственно, для определения нарастания титра антител исследованию подвергаются 2 образца сыворотки крови, взятых с указанным интервалом

Иммуноферментный метод (иммуноферментный анализ, ИФА) - определение Аг или Ат с помощью Ат или Аг, ковалентно соединенных с ферментом (чаще пероксидазой хрена, реже - b-глюкуронидазой, щелочной и кислой фосфатазами). Образующийся иммунный комплекс выявляют с помощью фотометрического измерения оптической плотности окрашенных продуктов, которые образуются в результате ферментативного расщепления субстрата ферментом. Иммуноферментные реакции применяют для диагностики инфекционных болезней (СПИДа, вирусных гепатитов, хламидиоза, токсоплазмоза и др.), определения содержания гормонов, и др. Для метода характерна высокая специфичность и чувствительность; высокий уровень автоматизации создается благодаря наличию специальных анализаторов и стандартных тест-систем. Различают прямой способ, когда ферментом метят специфические Ig (Ат), и непрямой, при котором иммунный комплекс выявляют мечеными антииммуноглобулинами.

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции) - метод выявления специфических Аг (Ат) с помощью Ат (Аг), конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения Ат и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Прямая РИФ состоит в обработке среза ткани или мазка из патологического материала или микробной культуры специфическими Ат, конъюгированные с флюорохромом; препарат промывают для освобождения от несвязанных Ат и исследуют в люминесцентном микроскопе. В положительных случаях по периферии объекта появляется светящийся иммунный комплекс. Необходим контроль для исключения неспецифического свечения. При непрямой РИФ на первом этапе срез ткани или мазок обрабатывают нефлюоресцирующими специфическими антителами, на втором -- люминесцирующими антителами к g-глобулинам того животного, сыворотка которого была применена на первом этапе. В положительном случае образуется светящийся комплекс, состоящий из Аг, Ат к нему и Ат против Ат (сэндвич-метод).

Иммунохроматографический метод основан на ИФА. Но все диагностические компоненты сорбированы на специальном носителе. Исследуемый материал (в объеме порядка 10 мкл) помещается на один из концов этого носителя и всасывается в него, при соответствии антител исследуемого материала и диагностических компонентов (т.е. антигенов возбудителя) происходит их связывание, проявляющееся окрашиванием полоски носителя. В настоящее время данный метод применяется в качестве экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.

ПЦР дает возможность существенно ускорить и облегчить диагностику вирусных заболеваний. Нужный ген амплифицируют с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров, а затем секвенируют для определения мутаций. Вирусные инфекции можно обнаруживать сразу после заражения, за недели или месяцы до того, как проявятся симптомы заболевания.