3.7. Основные принципы культивирования микроорганизмов

Для выделения чистой культуры микроорганизмов, изучения их биологических свойств с целью идентификации, а также для получения биомассы необходимо размножить микроорганизмы в условиях лаборатории. Культивирование, или выращивание, микробов возможно лишь при создании определенных условий для их жизнедеятельности. Большинство бактерий, дрожжей, плесеней культивируют на искусственных питательных средах. Вирусы и риккетсии размножаются только в живых клетках, культуре тканей, курином эмбрионе или в организме животного.

Искусственные среды, применяемые для культивирования микроорганизмов, должны соответствовать определенным требованиям: быть легкоусвояемыми, с необходимым составом азотистых и углеводных веществ, витаминов, необходимой концентрацией солей, с определенным водородным показателем (рН среды); обладать буферными- свойствами; иметь оптимальный окислительно-восстановительный потенциал.

Питательные среды должны также содержать достаточное количество воды и обязательно быть стерильными, т. е. до посева не содержать микроорганизмов. Источником азота в средах могут быть различные органические, редко - неорганические соединения. Часто к безбелковым средам добавляют пептон, представляющий собой продукт неполного гидролиза белка. Протеолитические микроорганизмы в качестве азотистого вещества могут использовать желатин («животный студень»). Источником углерода в питательных средах чаще служат углеводы, спирты, некоторые органические кислоты.

Для приготовления искусственных питательных сред можно использовать различные естественные продукты: молоко, кровь, сыворотку, мясо, желток куриного яйца, картофель и другие органические вещества и минеральные соли.

Искусственные питательные среды по назначению подразделяют на четыре основные группы: универсальные, специальные, избирательные (элективные) и дифференциально-диагностические.

К универсальным средам относят мясо-пептонный бульон и мясо-пептонный агар, на которых растут многие виды патогенных и непатогенных бактерий. Специальные среды применяют для выращивания бактерий, не размножающихся на универсальных средах. К специальным относят среды с молоком, сывороткой крови, с добавлением крови животных, глюкозы и др. На них выращивают молочнокислые бактерии, патогенные и другие микроорганизмы.

В избирательных (элективных) средах хорошо развиваются только бактерии определенных видов. К таким средам относятся среды обогащения, в которых интересующий исследователя вид растет быстрее сопутствующих бактерий. Например, среда Кесслер, содержащая в своем составе генцианвиолет и желчь крупного рогатого скота, элективна для устойчивых к. этим веществам грамотрицательных кишечных палочек и вместе с тем селективна для чувствительных грамположительных бактерий.

Дифференциально-диагностические среды используют для дифференциации определенных видов бактерий по их культуральным и биохимическим свойствам. К ним относятся:

среды для определения протеолитической активности (мясопептонный желатин - МПЖ, молочный агар и др.);

среды для определения ферментации углеводов (среды Гисса, Эндо, Плоскирева и др.);

среды для определения гемолитической способности (кровяной агар и другие среды с добавлением крови животных);

среды для определения восстановительной (редуцирующей) способности микроорганизмов (среда Вильсон-Блера);

селективные среды, применяемые для дифференциации прототрофных и ауксотрофных бактерий.

По консистенции питательные среды могут быть плотными, полужидкими и жидкими. Для получения сред плотной консистенции' к жидким средам добавляют 2-2,5 % агара или 10-20 % желатина. Полужидкие среды получают при добавлении 0,5- 1,0 % агара. Агар (по-малайски «желе») - плотное волокнистое вещество, получаемое из красных водорослей и образующее в водных растворах плотный гель (студень). Он состоит в основном из полисахаридов (70-75 %). Основными компонентами агара являются высокомолекулярные вещества агароза и агаропептин, которые не расщепляются и не усваиваются микроорганизмами. В связи с этим агар не является питательным субстратом, его добавляют в среды исключительно для получения плотной консистенции. Агар расплавляется в воде при 100 °С, а застывает при 40-43 °С. Его выпускают в виде желтоватых пластинок или серовато-белого порошка.

Осмотические условия, необходимые для жизнедеятельности микробов, создают в питательной среде добавлением хлорида натрия или определенным сочетанием солей фосфата натрия и фосфата калия.

Для жизнедеятельности микроорганизмов большое значение имеет реакция среды - водородный показатель (рН), который определяется соотношением водородных (Н⁺) и гидроксильных (ОН^-) ионов. Он представляет собой логарифм числа абсолютной концентрации водородных ионов.

Водородный показатель нейтральной реакции соответствует 7,0. В этом случае число водородных ионов равно числу гидроксильных. Показатель ниже 7,0 указывает на кислую реакцию, а выше 7,0 - на щелочную. Микроорганизмы приспособились развиваться в условиях с чрезвычайно широким диапазоном рН - от 2,0 до 8,5. Большинство сапрофитных и патогенных микроорганизмов культивируют при слабощелочной реакции среды с рН 7,2-7,4. Для культивирования молочнокислых бактерий, дрожжей и плесеней необходима кислая реакция среды, рН 5,0-6,5.

В настоящее время многие питательные среды выпускают в виде готовых сухих сред-полуфабрикатов, содержащих все необходимые для жизнедеятельности микроорганизмов ингредиенты. Для приготовления питательной среды порошок разводят водой, полученную смесь кипятят, устанавливают необходимое значение рН и стерилизуют.

Большое значение для роста и размножения микроорганизмов на искусственных питательных средах имеют температурные условия. По отношению к температурному режиму все микроорганизмы делят на три группы: психрофильные (холодолюбивые), мезофильные (средние), термофильные (теплолюбивые). Температурные границы размножения у психрофилов составляют от 0 до 20 °С, у мезофилов - от 20 до 45 °С, у термофилов - от 45 до 70 °С.

При выращивании аэробов посевы культивируют в термостатах при доступе кислорода воздуха, т. е. в обычных условиях. Для культивирования анаэробов создают бескислородные условия, которые можно достичь физическими, химическими и биологическими методами. Используют также анаэробные термостаты.

Физические методы основаны на создании вакуума в специальных аппаратах анаэростатах или в вакуум-эксикаторах, в которые сначала помещают посевы, а затем в аппаратах создают разрежение.

Иногда воздух в анаэростатах заменяют углекислым газом, азотом или другим инертным газом. Доступ кислорода в питательную среду можно затруднить, если культивировать анаэробов в глубине столбика питательного агара или внутри запаянных стеклянных трубок. Анаэробные условия можно создать и более простыми способами: с помощью слоя агара, залитого поверх посевов на плотной питательной среде, или с помощью вазелинового масла, которым покрывают жидкую питательную среду (среда Китта-Тароцци).

Химические методы заключаются в том, что в эксикатор с посевами помещают химические вещества, например пирогаллол и щелочь, реакция между которыми идет с поглощением кислорода.

Биологический метод основан на одновременном культивировании аэробов и анаэробов на плотных питательных средах в герметически закупоренных чашках Петри. При этом кислород поглощается растущими аэробами, посеянными на одной половине среды, после чего начинается рост анаэробов, посев которых сделан на другой половине.