15.3. Выделение чистых культур молочнокислых бактерий и определение их производственной ценности
Для поддержания заквасок в наиболее активном состоянии необходимо постоянно производить замену заквасочных штаммов, что связано с изменением биологических свойств заквасочных микроорганизмов при их длительном культивировании и хранении.
Этим обусловлена необходимость выделения чистых культур молочнокислых бактерий с целью получения производственноценных штаммов заквасочных микроорганизмов.
Выделение чистых культур молочнокислых бактерий включает ряд этапов: выбор источников, отбор образцов, посев на жидкую питательную среду для обогащения молочнокислой микрофлорой, посев на плотную среду для выделения чистой культуры, пересев чистой культуры (колоний) в стерильное молоко, исследование биологических свойств выделенных штаммов в целях их идентификации и определения производственной ценности (схема 3).
Источниками выделения мезофильных молочнокислых бактерий являются сырое молоко, оборудование, самоквасные кисломолочные продукты, а также растения, корни растений, иногда почва, расположенная в зоне корневой системы.
Темофильные молочнокислые стрептококки и болгарскую палочку выделяют из самоквасных кисломолочных продуктов южных регионов; ацидофильную палочку — из содержимого кишечника телят и грудных детей. Теморфильную палочку Lbm. helveticum выделяют из твердых сыров с высокой температурой второго нагревания (типа швейцарского). Для выделения мезофильных молочнокислых стрептококков 1 г пробы растирают в стерильной ступке и готовят разведение 1 : 10 на физиологическом растворе. Полученную суспензию засевают в стерильное молоко (10 см3 в объеме 0,25-0,5 см3). Если культуру выделяют из кисломолочных продуктов, то одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное молоко. Посевы термостатируют при 25-30 °С до свертывания молока.
Схема 3 ‑ Выделение штаммов для заквасок
При выделении ароматобразующих мезофильных стрептококков после посева суспензии образцов в обезжиренное стерильное молоко (питательная среда) добавляют цитрат натрия (1 %) или дрожжевой автолизат (2 %) с глюкозой (1 %). Процесс выделения чистых культур термофильных бактерий аналогичен процессу выделения мезофильных молочнокислых стрептококков. При этом термофильные молочнокислые стрептококки и палочки, культивируют при 40-43 °С, за исключением ацидофильной палочки, которую выращивают при 37 °С.
После проверки сгустка на типичность органолептических свойств и микрофлоры полученную обогащенную культуру, выращенную на стерильном молоке, высевают на плотную питательную среду (агар с гидролизованным молоком). Посевы термостатируют в течение 48 ч.
Колонии просматривают под малым увеличением микроскопа. Типичными колониями для Lac. lactis являются поверхностные округлые и глубинные лодочкообразные колонии. Lac. cremoris образует округлые темные колонии с выраженной зернистостью, Lac. diacetylactis формирует глубинные колонии неправильной формы в виде кусочков ваты, в микроскопических препаратах, приготовленных из таких колоний, клетки имеют палочковидную форму. Термофильные стрептококки образуют правильной округлой формы темные колонии с четко выраженной зернистостью. Термофильные молочнокислые палочки образуют, как правило, колонии неправильной формы в виде «паучков» или кусочков ваты.
Типичные для каждой группы микроорганизмов колонии переносят в пробирки с молоком. Из одного образца (из одной чашки Петри) выделяют по 5 колоний, посевы термостатируют до образования сгустка но не более 48 ч.
Выделенные штаммы молочнокислых бактерий характеризуют по микроскопической картине, продолжительности (активности) свертывания молока и органолептическим свойствам.
Штаммы, имеющие неравномерные по размеру клетки, инволюционные формы, загрязненные посторонней микрофлорой, отбраковываются. Сгусток молока должен быть ровным, плотным, с чистыми кисломолочными вкусом и запахом. Кислотность сгустка через 10 ч должна быть 80-85 °Т, через 24 ч — 100-110 °Т (у активных кислотообразователей).
Энергия кислотообразования для Lac. lactis должна составлять 4-6 ч, для Lac. cremoris - 5-7 ч, Lac. diacetylactis должен свертывать молоко через 16-24 ч, a Lbm. acidophilum - через 4-5 ч.
Штаммы термофильных стрептококков и болгарской палочки отбирают средней и высокой активности свертывания. Штаммы Str. thermophilus высокой активности молоко свертывают через 3,5-4 час, штаммы средней активности образуют сгусток через 5-7 час. Активные штаммы болгарской палочки свертывают молоко через 3-3,5 час, а штаммы средней активности - через 5-7 час. Термофильный стрептококк и болгарская палочка используются в симбиотической закваске для кисломолочных продуктов «южного» типа.
Активность свертывания и органолептические свойства выделенных штаммов являются наиболее важными и решающими показателями, определяющими пригодность их для использования в производстве. Кроме того, мезофильные молочнокислые стрептококки оценивают по следующим тестам: резистентность к бактериофагу, рост в лакмусовом молоке при температуре 45 °С, образование аммиака из аргинина, образование диацетила, ацетоина и углекислого Таза (для ароматобразующих стрептококков), способность к подавлению термоустойчивой молочнокислой палочки.
Для использования в производстве отбирают штаммы всех видов мезофильных молочнокислых стрептококков, не дающих роста в лакмусовом молоке при 45 °С, резистентные к поливалентному бактериофагу и нелизогенные, подавляющие рост и кислотообразующую способность термоустойчивой молочнокислой палочки.
Штаммы, образующие аммиак из аргинина, не продуцирующие диацетила, ацетоина и углекислого газа, относят к Lac. lactis.
Штаммы, не образующие аммиака из аргинина, не продуцирующие диацетила, ацетоина и углекислого газа, относят к Lac. cremoris.
Штаммы, образующие диацетил, ацетоин, углекислый газ и аммиак из аргинина, относят к ароматобразующему виду Lac. diacetylactis.
Для использования в производстве отбирают штаммы термофильного стрептококка, не развивающиеся в молоке с пенициллином (0,01 МЕ/см3), развивающиеся в гидролизованном молоке в присутствии не более 2 % NaCI и 0,1 % метиленового голубого.
Из термофильных молочнокислых палочек в производстве используют штаммы, дающие рост в молоке при 45 °С и не растущие при температуре 15°С, имеющие предел кислотообразования 200-250 °Т.
Кроме того, штаммы ацидофильной палочки должны быть устойчивыми не менее чем к 0,4 % фенола, 20 % желчи, рН среды 8,3 и обладать выраженной антибиотической активностью по отношению к гнилостной микрофлоре, стафилококку, палочке протея и кишечным палочкам. Штаммы болгарской палочки должны образовывать ацетальдегид.
Исследование выделенных штаммов по вышеперечисленным тестам дает возможность идентифицировать их до вида. Более полная идентификация молочнокислых бактерий по биологическим свойствам проводится по Показателям, рассмотренным в главе 9.
Из проверенных и отобранных ценных штаммов молочнокислых бактерий составляют коллекцию, которую сохраняют путем пересевов штаммов в стерильное молоко не реже одного раза в месяц. При этом штаммы нередко снижают свою биохимическую активность (пассажная спонтанная изменчивость). Поэтому 1-2 раза в год штаммы проверяют по их активности, чистоте, биохимическим и органолептическим свойствам.
Отобранные производственно-ценные штаммы молочнокислых бактерий можно хранить также в замороженном виде при -18 - (-25) °С в течение 4-6 мес. или в высушенном состоянии после сублимационной сушки. В последнем случае запаянные ампулы с сухими культурами выдерживают хранение при низкой положительной (3-5°С) или отрицательной (-18 - (-25°С) температуре в течение нескольких лет (до 10 и более).