9.1.2. Лейконостоки
Систематика. Род Leuconostoc (от греч. leucos - белый, бесцветный; nostoc — водорослевое обобщенное название; leuconostoc -бесцветные слизистые растения) объединяет 9 видов: Leu. mesenteroides, Leu. lactis, Leu. amelibiosum, Leu. carnosum, Leu. citreum, Leu. gelidum, Leu. oenos, Leu. paramesenteroides, Leu. pseudomesenteroides.
В молочной промышленности имеет значение вид Leu. mesenteroides, он включает три подвида: Leu. mesenteroides subsp. dextranicum (сокращенно - Leu. dextranicum); Leu. mesenteroides subsp. cremoris (Leu. cremoris) и Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides (Leu. mesenteroides). Их дифференцирующие особенности приведены в табл. 6.
Морфология. Лейконостоки имеют сферические, несколько вытянутые клетки размером 0,5-0,7 х 0,7-1,2 мкм. Располагаются парами или цепочками. По Граму красятся положительно, неподвижные, спор не образуют (рисунок 20).
Leu. cremoris имеет клетки, которые обычно выстраиваются в длинные двойные цепочки.
У лейконостоков на морфологию клеток могут влиять условия выращивания микроорганизмов. При культивировании в молоке или на средах с добавлением молока большинство штаммов образуют коккоподобные клетки в коротких цепочках. При культивировании в бульоне клетки лейконостоков удлиняются и могут принимать вид палочек, проявляясь морфологически ближе к лактобактериям, чем к стрептококкам
Рисунок 20 ‑ Leuconostoc mesenteroides: а - круглые плотные колонии; б - кокковая форма, круглые клетки, окруженные слизью
Культуральные свойства. Лейконостоки являются факультативными анаэробами. Растут на специальных питательных средах. Оптимальная температура роста 20-30 ˚С, а минимальная составляет 5 ˚С.
По сравнению с лактококками лейконостоки более требовательны к составу питательных сред.
Молоко является бедной питательной средой для развития лейконостоков. Большинство штаммов растет в молоке при добавлении ростовых факторов, экстракта дрожжей и глюкозы.
Для всех видов лейконостоков необходимы для их развития аминокислоты и комплексные факторы роста - никотиновая кислота + биотин и пантотеновая кислота или производные от этой кислоты; цианкобаламин (витамин В12) и р-аминобензойная кислота не требуются. Для роста Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides необходимы глутаминовая кислота и валин, рибофлавин, пиридоксаль и фолиевая кислота. Leu. dextranicum в качестве фактора роста использует также твин-80.
Ростовый комплекс гуанин + аденин + ксантин + урацил необходим Leu. cremoris, Leu. paramesenteroides и Leu. oenos.
Лейконостоки на плотных средах образуют мелкие (до 1 мм в диаметре) гладкие круглые серовато-белые колонии (рисунок 20); на средах, содержащих сахарозу, образуют мелкие слизистые колонии. При посеве лейконостоков уколом на плотную среду развиваются вдоль укола с небольшим поверхностным ростом. Бульонные культуры часто имеют однородное помутнение, но штаммы, образующие длинные цепочки, имеют тенденцию к образованию осадка.
Рост лейконостоков никогда не бывает быстрым. Наиболее активными являются штаммы Leu. mesenteroides subsp. mesenteroides, имеющие самое короткое время генерации. Его хороший рост может быть получен в течение 24-часовой инкубации при 30°С. Leu. mesenteroides subsp. cremoris вырастает в течение 48 ч при температуре 22-30 °С. При культивировании медленно растущих штаммов к бульонным средам добавляют 0,05 % солянокислого цистеина. Leu. oenos несколько отличается от других видов. Он лучше растет в кислой среде, содержащей томатный сок, с начальной рН 4,2-4,8. Растет медленно, его культивируют при 22 °С в течение 5-7 дней. Другие виды лейконостоков не могут расти в кислотных средах, предпочтительных для Leu. oenos.
Биохимические свойства. Лейконостоки являются хемоорганотрофами с облигатной потребностью в сбраживаемом углеводе.
Они ферментируют глюкозу с образованием кислоты и обычно газа; основными продуктами брожения являются также этанол, D(-)-изомер молочной кислоты и ароматические вещества - диацетил, ацетоин и 2,3-бутиленгликоль.
Лейконостоки являются слабыми кислотообразователями, молоко часто не свертывают, протеолитической активностью не обладают, индол и аммиак не образуют, нитраты не восстанавливают. Конечную рН при росте в жидкой среде с глюкозой доводят до 4,4-5,0.
Leu. mesenteroides subsp. dextranicum является слабым кислотообразователем, свертывает молоко через 2-3 сут. Предельную кислотность доводит до 70-80 °Т.
Leu. mesenteroides subsp. cremoris медленно развивается в молоке и его не сквашивает, так как предельная кислотность достигает только 40-50°Т.
Основную массу диоксида углерода лейконостоки вырабатывают из лимонной кислоты, поэтому добавление ее в молоко способствует образованию СО2. Кроме того, бактерии рода Leuconostoc способны образовывать диоксид углерода посредством гетероферментативного расщепления молочного сахара.
Этиловый спирт лейконостоки образуют под действием ферментов фосфокетолаз. Некоторые штаммы имеют окислительный механизм метаболизма и вместо этилового спирта образуют уксусную кислоту.
Большинство видов лейконостоков усваивают цитраты, с образованием ароматических веществ - ацетоина и диацетила, но это свойство может быть утрачено у штаммов, сохраняемых длительное время в лабораторных условиях.
Установлено стимулирующее воздействие марганца на рост и образование диацетила бактериями рода Leuconostoc.
Количество марганца в коровьем молоке зависит от времени года: весной его содержание составляет 8-20 мкг/л, летом и осенью -25-85 мкг/л.
В связи с этим в масле, изготовленном с помощью заквасок, содержащих Leuconostoc, весной диацетила будет меньше, чем летом и осенью.
Образование диацетила и ацетоина в заметных количествах наблюдается только у Leu. cremoris и Leu. dextranicum. Оптимальная температура ароматообразования составляет 18-20 °С. Оно происходит только при низком значении рН (меньше 6,0), т.е. при накоплении в большом количестве молочной кислоты
С учетом этого Leu. cremoris и Leu. dextranicum с наибольшим эффектом ароматообразования используют в многоштаммовых заквасках в сочетании с Lac. lactis или Lac. cremoris или обоими вместе.
Применение Leu. cremoris наиболее целесообразно там, где необходимо получить мягкий долговременный аромат, например, в производстве стойкого к хранению масла.
Leu. dextranicum вместе с другими ароматобразующими стрептококками чаще вводят в состав заквасок для сыров.
Лейконостоки обладают липолитической активностью. Они в состоянии расщеплять триглицериды, но прежде всего моно- и диглицериды, встречающиеся в молоке, сыре и масле после воздействия молочных и бактериальных липаз. Липолиз высвобождает жирные кислоты (масляную, капроновую, каприловую, каприновую, меристиновую, олеиновую) и их продукты распада, что может привести к порокам вкуса.
Многие штаммы Leu. mesenteroides образуют слизь из декстранов и сахарозы. Слизь интенсивнее образуется при 20-25 °С. Штаммы, не образующие слизь, не выдерживают нагревания в бульоне с глюкозой при 55 °С в течение 30 мин. Слизеобразующие штаммы сохраняют жизнеспособность в слизистых сахарных растворах, нагреваемых до 80-85 °С.
Лейконостоки распространены на растениях, в молочных и других пищевых продуктах. Leu. citreum и Leu. pseudomesenteroides выделены из организма человека.
Таблица 6 ‑ Дифференцирующие признаки подвидов Leu. mesenteroides
Признак |
Subsp. cremoris |
Subsp. dextranicum |
Subsp. mesenteroides |
Лимонно-желтый пигмент |
+ |
- |
- |
Образование кислоты из: L-арабинозы |
- |
- |
+ |
Фруктозы |
- |
+ |
+ |
Мальтозы |
± |
+ |
+ |
Мелибиозы |
± |
+ |
+ |
Салицина |
- |
± |
± |
Сахарозы |
- |
+ |
+ |
Трегалозы |
- |
+ |
+ |
Образование декстрана из сахарозы |
- |
+ |
+ |
Гидролиз эскулина |
- |
± |
± |
Рост при рН 4,8 |
- |
- |
- |
Рост при 37 °С |
- |
+ |
± |
Обозначения: "+" - 90 % и более штаммов положительные; "±" - 21-79 % штаммов положительные; "±" - 11-20 % штаммов положительные; "-" - 90 % и более штаммов отрицательные;