Раздел іі специальная микробиология

Глава 9. Микроорганизмы, используемые при производстве молочных продуктов

К основным группам микроорганизмов, используемым при производстве молочных продуктов, относят молочнокислые, пропионовокислые бактерии, бифидобактерии, уксуснокислые бактерии и дрожжи. В созревании сыров со слизевой поверхностью участвует незаквасочный пигментообразующий микроорганизм слизи Brevibacterium lines.

9.1. Молочнокислые бактерии

Это специфическая группа микроорганизмов, обусловливающих молочнокислое брожение, т. е. распад углеводов (сахаров) до молочной кислоты. Наряду с основным продуктом брожения - молочной кислотой -образуются побочные продукты: уксусная кислота, углекислый газ, ароматические вещества, этиловый спирт и др.

Первые научные исследования этих микроорганизмов были проведены Л. Пастером, результаты которых он опубликовал в 1857 г. С тех пор молочнокислые бактерии привлекают к себе пристальное внимание специалистов. На основе использования этих микроорганизмов создаются и развиваются крупные отрасли народного хозяйства.

В природе молочнокислые бактерии представлены в виде шаровидных (кокков) и палочковидных (лактобактерий) форм. Шаровидные молочнокислые бактерии называют молочнокислыми стрептококками, так как они относятся к семейству Streptococcaceae.

Молочнокислые стрептококки представлены тремя родами -Lactococcus (Lac), Leuconostoc (Leu.) и Streptococcus (Str.).

9.1.1. Лактококки

Систематика. Род Lactococcus (от греч. lacticus - молочный) включает пять видов, типовым из которых является Lactococcus lactis (молочный лактококк). Он объединяет три подвида: Lac. lactis subspecies (subsp.) lactis (молочный лактококк - сокращенно Lac. lactis), Lac.lactis subsp. cremoris (сливочный лактококк - сокращенно Lac.cremoris) и Lac. lactis subsp. hordniae - сокращенно Lac. hordniae. В подвид Lac. lactis subsp. lactis отнесен ароматобразующий биологический вариант, который называется Lac. lactis subsp. lactis biovar diacetylactis.

В прежних изданиях «Определителя бактерий» Берджи его называли Str. diacetylactis. Для удобства мы будем называть его сокращенно Lac. diacetylactis. В последнее время биовар diacetylactis предложено выделить в подвид молочного лактококка.

Остальные четыре вида, относящиеся к роду Lactococcus: Lac. garvieae, Lac. piscium, Lac. plantarum, Lac. raffinolactis, а также подвид Lac. lactis subsp. hordniae перенесены в род Lactococcus из других родов. Эти микроорганизмы изучены в молочной промышленности недостаточно и большого значения не имеют.

Представители вида Lac. lactis (за исключением подвида Lac. lactis subsp. hordniae) широко используются в молочной промышленности. Они очень схожи между собой, продуцируют неразличимые молочные дегидрогеназы, обладают общим ферментом Р-фосфогалактазой и все идентичны по содержанию моль % Г+Ц (гуанина + цитозина) в ДНК (38,6), гомология ДНК/ДНК составляет не менее 50 %.

Лактококки являются в основном гомоферментативными микроорганизмами, исключение составляет биовар diacetylactis. Он образует ароматические вещества - диацетил и ацетоин, способен усваивать соли лимонной кислоты (цитраты) и в связи с этим относится к группе, так называемых, стрептококков цитроворусов. В эту группу также входят два основных представителя рода Leuconostoc -Leu. cremoris и Leu. dextranicum.

Морфология. Лактококки представляют собой сферические или овальные клетки размером 0,5—1,2 х 0,5-1,5 мкм, располагающиеся в виде коротких цепочек или попарно; неподвижны, спор и капсул не образуют, по Граму красятся положительно. В молодых культурах некоторые штаммы сливочного стрептококка образуют слизистую капсулу. Клетки Lac. diacetylactis несколько мельче, чем клетки Lac.lactis и Lac.cremoris. Lac. cremoris часто образует длинные цепочки (рис 18,19).

Культуральные свойства. Лактококки являются факультативными анаэробами, т. е. растут не только в аэробных условиях, но и без доступа молекулярного кислорода. Однако, в присутствии кислорода у них не изменяется тип дыхания, так как не проявляется аэробное дыхание, а продолжается процесс брожения, т.е. анаэробного дегидроденирования. В связи с этим лактококки, как и все молочнокислые бактерии, можно отнести к категории аэротолерантных (воздухотерпимых) микроорганизмов.

По отношению к температуре лактококки являются мезофилами, их оптимальная температура роста 30 °С, развиваются при 10 °С, но не при 45 °С. Многие штаммы Lac. lactis имеют широкий диапазон температур роста ‑ от 8 до 41 °С.

Имеются данные, что некоторые штаммы лактококков способны расти при очень низких плюсовых температурах (до 3 °С).

По потребности в питательных веществах молочнокислые стрептококки, так же как и бактерии, относятся к наиболее сложным микроорганизмам. В качестве источника углерода они могут использовать моно- и дисахариды, органические кислоты.

На обычных питательных средах они не развиваются, а растут на средах с добавлением аминокислот, гидролизатов белков мяса, лактальбумина, казеина, различных видов муки. Большинству штаммов лактококков необходимы аминокислоты: аргинин, лейцин, изолейцин, гистидин,валин.

Лактококкам, как и большинству молочнокислых бактерий, необходимы витамины: рибофлавин (В₂), тиамин (В1), пантотеновая (В₃), никотиновая (РР), фолиевая (Вс) кислоты, пиридоксин (В₆) и др. Этим объясняется положительное влияние на рост микроорганизмов добавок к питательным средам различных питательных экстрактов (кукурузы, моркови, картофеля), дрожжевого автолизата и других витаминсодержащих соединений. Рост лактококков стимулируют и некоторые пептиды, пурины (аденин, гуанин, гипоксантин), пиримидины (урацил, тимин), жирные кислоты (уксусная, олеиновая), а также лимонная кислота.

Лактококки, как и большинство молочнокислых бактерий, культивируют на обезжиренном стерильном молоке или на плотных и жидких искусственных питательных средах с использованием гидролизованного молока и других питательных веществ, получаемых из молока.

Гидролизованное молоко готовят следующим образом. Обычное или восстановленное обезжиренное молоко кипятят или стерилизуют при 121 °С 10-15 мин и охлаждают до 45 °С. Устанавливают рН 7,6-7,8. К 1 дм³ молока добавляют 0,5-1,0 г порошка панкреатина или 2-3 г поджелудочной железы, пропущенной несколько раз через мясорубку (порошок панкреатина предварительно разводят в небольшом количестве теплой воды). Затем к молоку добавляют 5 см³ хлороформа. Колбу закрывают корковой пробкой, тщательно перемешивают и выдерживают в термостате при 40 °С в течение 18-24 ч. В течение 2-3 ч молоко несколько раз перемешивают (пробку после встряхивания приоткрывают для удаления паров хлороформа). Через 18-24 ч колбу вынимают из термостата, гидролизованное молоко фильтруют через бумажный фильтр, разводят в 2 раза водой, устанавливают рН 7,0-7,2 и стерилизуют при 121 °С 15 мин.

Агар с гидролизованным молоком и мелом представляет собой гидролизованное молоко (основа), к которому добавляют 2 % агара и 2-3 % мела в виде тонкоизмельченного порошка. Среду стерилизуют при 121 °С 15 мин. Его используют для количественного учета молочнокислых бактерий в молоке и молочных продуктах.

Для выделения чистых культур молочнокислых бактерий и для изучения их культуральных свойств используют агар с гидролизованным молоком (без мела).

Для получения стерильного обезжиренного молока его разливают в пробирки (1/3 часть их емкости) и затем стерилизуют при 121 °С в течение 10 мин. Молоко должно иметь кислотность 16-18 °Т.

При развитии лактококков в молоке они вызывают его свертывание, т. е. образование ровного, без обильного отделения сыворотки плотного сгустка, имеющего приятные кисломолочные вкус и запах. Ароматобразующий лактококк образует сгусток, в котором можно обнаружить в небольшом количестве пузырьки углекислого газа.

При росте на гидролизованном молоке лактококки вызывают помутнение питательной среды.

На агаре с гидролизованным молоком и мелом они образуют мелкие (0,5-1 мм) каплевидные колонии с ровным краем и зонами просветления мела. Зоны просветления вокруг колоний обусловлены превращением (под действием молочной кислоты) нерастворимого углекислого кальция в растворимый лактат кальция. Колонии в толще питательной среды (глубинные колонии) имеют форму лодочки или зерна чечевицы (смотри рисунки 18, 19). Lac. diacetylactis на 3%-ном агаре может образовывать глубинные колонии в виде паучков или комочков ваты, напоминающие колонии молочнокислых палочек.

Лактококки растут в средах с низким значением рН - от 5,5 до 8,8, некоторые - при рН 2,9-3,2. Характерным свойством молочнокислых стрептококков и палочек является высокая спиртоустойчивость. Они могут развиваться на питательных средах, содержащих 15-18 % этилового спирта, реже - 24 %.

Биохимические свойства лактококков изучают по энергии кислотообразования, предельной кислотности, способности ферментировать соли лимонной кислоты, по качеству сгустка, возможной протеолитической активности бактерий и др.

Энергию (интенсивность) кислотообразования определяют по времени образования сгустка молока (кислотность около 58-60 °Т) при внесении 0,5 см³ молодой (12-20-часовой) культуры в 10 см³ стерильного обезжиренного молока и выращивании посевов при оптимальной температуре.

Кислотность молока, выраженную в градусах Тернера, определяют при титровании децинормальным раствором едкого натра с индикатором фенолфталеином. Для титрования берут 10 см³ молока, разбавленного 20 см³ воды (можно брать в 2 раза меньше). Объем щелочи (в см³), пошедшей на нейтрализацию кислоты, умножают на 10 (20) (т. е. производят перерасчет на 100 см³ молока) и получают таким образом кислотность молока в градусах Тернера (1°Т соответствует 9 мг молочной кислоты в 100 см³ молока).

Качество сгустка определяют тотчас после его образования. Лактококки образуют ровный, плотный, гомогенный кислотный сгусток; без отделения сыворотки; с кисловатым, приятным вкусом. Если сгусток стягивается с отделением сыворотки, то это дает основание предположить наличие в молоке сычужного фермента, выделяемого маммококками (Enterococcus faecalis var. liquefaciens) и микрококками. При этом образуется смешанный сычужно-кислотный сгусток. Чистый сычужный сгусток, который быстро полностью растворяется, образуют гнилостные бактерии.

Наличие в сгустке пузырьков газа (особенно, если их много) дает основание предположить загрязнение культуры бактериями группы кишечных палочек или дрожжами.

Протеолитическую активность молочнокислых бактерий изучают на мясопептонном желатине, молоке, молочном агаре или определяют с помощью специальных биохимических исследований и судят о ней по общему количеству образовавшихся водорастворимых продуктов распада белка, образованию аммиака, сероводорода, индола, которые характеризуют глубокий распад белковых веществ.

Способность сбраживать соли лимонной кислоты (цитраты) определяют посевом бактерий на плотную среду с цитратом кальция. Появление зон просветления вокруг колоний свидетельствует об образовании водорастворимых продуктов брожения при наличии фермента цитритазы.

Активность образования ароматических веществ устанавливают по количеству образовавшихся летучих соединений (методом возгонки) и четырехуглеродных соединений (диацетила и ацетоина).

Лактококки обладают различной ферментативной активностью. Они ферментируют углеводы с образованием L (+)-молочной кислоты, но, как правило, без газа.

Lac, lactis является активным кислотообразователем. Его штаммы свертывают молоко за 4-7 ч, предельная кислотность достигает 120 °Т. Восстанавливает и свертывает лакмусовое молоко, не образует ацетоина, разлагает аргинин с образованием аммиака. Не развивается в щелочной среде при рН 9,5. Заключительная рН в жидких средах с глюкозой составляет 4,0-4,5.

При культивировании на искусственных средах многие штаммы теряют способность к быстрой ферментации лактозы и к протеолизу молока. Эти утраченные свойства могут восстанавливаться при культивировании лактококков в молоке. Lac. lactis образует кислоту из

Рисунок 18 ‑ Lactococcus lactis: a - колонии (поверхностные -округлые, глубинные - в виде чечевицы); б – клетки.

галактозы, глюкозы, мальтозы и лактозы. Не ферментирует арабинозу, ксилозу, сахарозу, трегалозу, салицин, инулин, глицерол и сорбитол.

Многие штаммы продуцируют антибиотик низин, который является полипептидом с молекулярной массой 3500. Он подавляет большинство стрептококков (но не энтерококков), стафилококков, микрококков, некоторые виды бацилл, лактобактерий, клостридий, актиномицетов.

При этом в отношении грамотрицательных бактерий низин бактерицидным действием не обладает.

Lac. lactis применяют в многоштаммовых заквасках совместно с Lac. cremoris, Lac. diacetylactis и видами рода Leuconostoc. В молочной промышленности его широко используют при производстве кисломолочных продуктов, кислосливочного масла, сыров.

Отдельные штаммы Lac. lactis, особенно при температуре около 30 °С, способны образовывать горечь и поэтому непригодны для использования в качестве бактериальных заквасок при производстве сыра.

Lac, cremoris в отличие от молочного лактококка не сбраживает мальтозу и декстрин, не растет при температуре 39-40 °С. При пониженных температурах культивирования (15-20 °С) некоторые штаммы образуют значительное количество летучих кислот, восстанавливают и свертывают (иногда только частично) лакмусовое молоко. Имеются слизеобразующие штаммы, формирующие вязкие сгустки молока. Их используют в заквасках для производства сметаны.

Кроме того, Lac. cremoris отличается от Lac. lactis неспособностью продуцировать аммиак из аргинина, отсутствием роста в бульоне с рН 9,2 и в бульоне, содержащем 4 % NaCl; неспособностью расти в молоке, содержащем 0,3 % метиленового синего.

Энергия кислотообразования у Lac. cremoris слабее, чем у Lac. lactis, и составляет 6-8 ч, а предельная кислотность — 110-115 °Т.

Отдельные штаммы синтезируют антибиотик диплококцин, представляющий собой растворимый в воде протеин, устойчивый к высоким температурам в кислой среде. Антибиотик обладает антагонистической активностью по отношению к другим штаммам.

Рисунок 19 ‑ Lactococcus cremoris: a - колонии; б - клетки

Lac. cremoris и частично к золотистому стафилококку (Staph. aureus). Практического значения диплококцин не имеет.

Lac. cremoris используют преимущественно там, где необходимо добиться вязкой консистенции, умеренного кислотообразования. Он входит в состав заквасок для сметаны, творога, масла, сыров.

Lac. cremoris встречается в сыром молоке и молочных продуктах, но в небольших количествах.

Ароматобразующий лактококк Lac. diacetylactis продуцирует фермент цитритазу, которая расщепляет цитраты с образованием диоксида углерода (СО₂) и ароматических веществ — ацетоина и диацетила.

Восстанавливает и свертывает лакмусовое молоко, устойчив к содержанию в среде 4 % NaCl, многие штаммы разлагают аргинин с выделением аммиака.

Lac. diacetylactis - сравнительно слабый кислотообразователь, имеет слабую энергию кислотообразования (более 16 ч), предельная кислотность в молоке достигает 70-100 °Т.

Сгусток молока содержит пузырьки газа (СО₂). Образование диоксида углерода может быть необходимым или нежелательным. Для получения глазков во многих видах сыра образование СО₂ необходимо. С другой стороны, оно не должно быть настолько сильным, чтобы обусловливать пороки рисунка сыра. В кисломолочных напитках присутствие диоксида углерода в известной степени улучшает вкус (легкий пикантный привкус).

Нежелательно наличие диоксида углерода во всех ферментированных молочных продуктах, упакованных в газонепроницаемую упаковку.

Газообразование намного сильнее при использовании в качестве питательной среды цельного молока по сравнению с обезжиренным.

При развитии ароматобразующего лактококка сгусток молока имеет специфический запах, обусловленный накоплением диацетила (собственно ароматического вещества), который имеет особое значение Для ароматизации масла. Он также желателен как ароматизирующий компонент в сливках, пахте и различных сортах свежего сыра.

Ацетоин (называемый также ацетилметилкарбинолом) не обладает выраженными ароматизирующими свойствами, но тесно связан с Диацетилом.

Диацетил восстанавливается в ацетоин через фермент диацетилредуктазу. Эта необратимая реакция происходит довольно интенсивно и ведет к потере аромата. Ее можно замедлить, храня культуры или молочные продукты при низких температурах (5 °С и ниже).

Самым важным исходным веществом для образования диацетила является лимонная кислота; обогащением питательной среды лимонной кислотой можно стимулировать продукцию ароматического вещества.

В присутствии сбраживаемого углевода идет расщепление лимонной кислоты и ее солей с образованием ацетата, пировиноградной кислоты и диоксида углерода; пировиноградная кислота преобразуется в диацетил. Способствует образованию диацетила присутствие кислорода.

Оптимальной температурой ароматообразования для Lac. diacetylactis является 25 °С.

Образование диацетила у Lac. diacetylactis не стимулируется присутствием марганца. В связи с этим на ароматообразование не оказывают отрицательного влияния сезонные колебания содержания марганца в молоке (в отличие от лейконостоков). Сезонные колебания связаны с, так называемым, "весенним" молоком, в котором отмечается снижение содержания питательных и минеральных веществ.

Lac. diacetylactis в качестве заквасочного микроорганизма используют при производстве молочных продуктов, в которых желательно сильное кислото- и ароматообразование, например, для приготовления масла, творога, сметаны, простокваши и разных сортов свежего сыра.

Таблица 5 ‑ Дифференцирующие признаки видов и подвидов рода Lactococcus

Показатель	Lac. gar-vieae	Lac. lactis				Lac. piscium	Lac. plan-tarum	Lac. raffino-lactis
		subsp. cremoris	subsp. hordniae	subsp. lactis	biovar diacety -lactis
Рост при 40'С	+	-	-	+	+	-	-	-
Рост в присутствии 4 % NaCl	+	-	-	+	+	ИД	+	-
Гидролиз аргинина	+	-	+	+	+	-	-	±
Образование кислоты из: Лактозы Маннитола Раффинозы	+ + -	+ - -	- - -	+ ± -	+ ± -	+ + +	- + -	+ ± +

Обозначения: "+" - 80-90 % или более штаммов положительные; "±" - 21-79 % штаммов положительные; "±" - 11-20 % штаммов положительные; "-" - 90 % или более штаммов отрицательные; "нд" - нет данных.

Негативное влияние при развитии ароматобразующего лактококка может проявляться тем, что в многоштаммовых заквасках при высоких температурах он подавляет развитие других видов из-за сильного образования диоксида углерода.

Дифференцирующие особенности других видов и подвидов рода Lactococcus представлены в таблице 5.