9.3. Бифидобактерий

Это облигатная и доминирующая часть кишечной микрофлоры здорового человека и теплокровных животных. Она проявляет антагонистическую активность по отношению к патогенным, условно-патогенным и нежелательным микроорганизмам в кишечнике.

В настоящее время идентифицировано 24 вида бифидобактерий (от лат. bifidus - раздвоенный, расщепленный надвое), объединенных в род Bifidobacterium, который относится к семейству Actinomycetaceae.

Наиболее изученными видами бифидобактерий являются: В. bifidum, В. adolescentis, В. breve, В. longum, В. infantis, В. pseudolongum, В. thermophilum и др. (таблица 15). Типовой вид - В. bifidum.

Содержание моль % гуанина + цитозина (Г+Ц) в молекуле ДНК бифидобактерий составляет 57-64.

Морфология. Бифидобактерий представляют собой чрезвычайно вариабельные по форме палочки - прямые, изогнутые, разветвленные, раздвоенные Y- или V-формы, булавовидные, лопатовидные. Клетки располагаются одиночно, парами, иногда цепочками, палисадом или розетками, размер клеток 0,5-1,3 х 1,5-8 мкм. Грамположительные, не образуют спор и капсул, неподвижные. Микроскопическая картина каждого вида бифидобактерий имеет особенности по размеру, форме и расположению клеток (рисунок 27).

При выращивании культур бифидобактерий на печеночном агаре или в молоке ветвление исчезает, клетки становятся грамвариабельными, слабее окрашиваются кислыми и щелочными красителями, появляется много гранулированных форм, которые иногда можно принять за кокки. Грануляция у бифидобактерий наблюдается также в средах с высоким содержанием сухих веществ.

Рисунок 27 ‑ A - В. bifidum, В - В. indicum, С - В. magnum, D - В. angulatum, E - B. asteroides, F - B. minimum

Ветвление происходит в среде, неполноценной в отношении источников питания. Появление полиморфных клеток у бифидобактерий индуцируется и катионами одновалентных металлов: калия, натрия, лития, цезия, а также исключением из среды культивирования одной из четырех аминокислот: DL-аланина, DL-серина, DL-аспарагиновой кислоты, Ь(+)-глутаминовой кислоты, смесь которых предотвращает ветвление клеток.

Среди штаммов, выделенных из кишечника взрослых людей, преобладают палочковидные и булавовидные формы; ветвящиеся палочки чаще встречаются у детей грудного возраста. На ранних стадиях развития у бифидобактерий преобладают палочковидные формы, а при дальнейшем культивировании образуются разветвленные нити с многочисленными перегородками в основном стволе и ответвлениях.

Культуральные свойства. Все виды бифидобактерий при первичном выделении являются строгими анаэробами. В присутствии углекислого газа они могут быть толерантными к кислороду. При лабораторном культивировании эти микроорганизмы приобретают способность развиваться в присутствии некоторого количества кислорода, а в высокопитательных средах - расти в полностью аэробных условиях. Чувствительность к кислороду у многих штаммов бифидобактерий варьирует, что обусловлено различиями в механизме брожения. Некоторые виды могут расти в атмосфере воздуха, обогащенного 10 % СО₂. Оптимальной является температура 37-41 °С. Оптимальное значение рН 6-7, при рН ниже 4,5 и выше 8,5 рост микроорганизмов прекращается.

Размножение бифидобактерий обусловлено огромным количеством факторов роста. Многие виды нуждаются в биотине, пантотеновой кислоте, цистеине, рибофлавине, пуриновых и пиримидиновых основаниях, пептидах, аминосахарах, коферменте А, олигосахаридах, некоторых ненасыщенных жирных кислотах и др. (табл. 15). Отдельные штаммы нуждаются в углекислом газе, аммиаке, гистидине. Из аминокислот требуется лизин, пролин, серии, аланин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты.

Некоторые штаммы бифидобактерий растут при наличии азотфиксирующих олигосахаридов - N-ацетил-глюкозамина, N-ацетил-галактозамина, N-ацетил-маннозамина и др., которые отсутствуют в коровьем молоке (содержатся в женском молоке).

В синтетических средах бифидобактериям для роста необходимы железо, магний, фосфаты, хлориды калия и натрия, в некоторых случаях -марганец.

Бифидобактерий культивируют, создавая анаэробные условия или снижая окислительно-восстановительный потенциал среды, на молоке, гидролизованном молоке и гидролизате казеина, а также на печеночном бульоне с добавлением ростовых веществ (дрожжевого автолизата,

Таблица 15 ‑ Дифференцирующие особенности биологических свойств бифидобактерий

Виды		Происхождение названия	Необходимые факторы роста	Содержание гуанина + цитозина в ДНК (моль %). Гомология ДНК/ДНК других видов	Кем выделен, когда, источник выделения
l.Bifidobacterium (В.) bifidum (Бифидобактериум (Б.) бифидум)		Bifidum - расщепленный, разделенный	Никотиновая и фолиевая кисло ты, твин-80, раминобензойная кислота	58; В. longum-40%; В. infantis - 42 %; В. boum-38%; В. pseudolongum - 35%	Tissier, 1900; обнаружен в фекалиях младенцев, вагине человека, в фекалиях молочных телят
2. В. longum (Б. лонгум)		Longum - длинный		58; В. infantis - 50-76%; В. breve- 40%	Reuter, 1963; из фекалий взрослых людей и младенцев
3. В. infantis (Б. инфантис)		Infantis - от младенца, младенческий	Пантотенат кальция, твин-80	58; В. longum - 50-76%; В. breve-40%; В. pullorum - 39 %	Reuter, 1963; из фекалий взрослых людей и младенцев, из вагины человека
4. В. breve (Б. бреве)		Breve короткий		58; В. infantis-40-60%; В. longum-40-60%; В. pullorum - 33 %; В. globosum - 25 %	Reuter, 1963; из фекалий взрослых людей и младенцев, из вагины человека
5. В. adolescentis (Б. адолесцентис)		Adolescentis - юношеский, подростковый	Рибофлавин, пантотенат кальция, никотиновая кислота, пиридоксин, тиамин	58; В. angulatum - 20 - 30%; В. catenulatum - 15- 57% В. animalis - 25 %	Reuter, 1963; из фекалий взрослых людей, обезьян и собак; сточных вод, рубца крупного рогатого скота (КРС)
6. В. angulatum (Б. ангулатум)		Angulatum - угловой, с углами	Рибофлавин, Пантотенат кальция	59; В. adolescentis - 20- 44%; В. catenulatum - 2- 37%; B.dentium-5-26%; В. minimum - 20 %	Scardovi, Crociani, 1974; из фекалий взрослых людей, сточных вод
7. В. catenulatum (Б. катенулатум)		Catenulatum - с наличием маленьких цепочек	Рибофлавин, пантотенаткальция	55; В. dentium- 16- 45%; В. adolescentis - 20- 57%; В. magnum - 26 %; В. bifidum - 25 %; В. minimum - 25 %	Scardovi, Crociani, 1974; из фекалий взрослых людей и младенцев, из сточных вод
8. В. pseudocatenulatum (Б. псевдокатенулятум)	Pseudo - ложный, ошибочный, т.е. не является catenulatum		Рибофлавин, пантотенат кальция, никотиновая кислота	57; В. eatenulatum -50- 80%; В. adolescentis - 30%; В. choerinum - 25 %; В. suis - 25 %; В. minimum - 25 %	Scardovi, Trovatelli, Biavari, Zani, 1979; из фекалий младенцев, молочных телят, сточных вод
9. В. dentum (Б. дентум)	Dentum - зубной		Рибофлавин, пантотенат кальция	61; В. adolescentis - 24-49%; В. angulatum - 8 - 20%; В. catenulatum -3- 48%	Scardovi, Crociani, 1974; из зубов, пораженных кариесом; из фекалий взрослых людей и младенцев, из ротовой полости и вагины человека
10. В. globosum (Б. глобозум)	Globus - шар, сфера, globosum - сферический		Рибофлавин, Пантотенат кальция, тиамин, фолиевая кислота	64; В. pseudolongum-65-70%; В. cuniculi -50-67; В. choerinum - 26 - 57%	Scardovi, Trovatelli, Crociani, Sgorbati, 1969; из фекалий свиней, молочных телят, крыс, кроликов, ягнят; из рубца КРС и сточных вод
11. В. pseudolongum (Б. псевдолонгум)	Pseudo - ошибочный, ложный, т.е. не является В. Iongum			60: В. globosum -75 %; В. choerinum - 37%; В. animalis - 34 %	Mitsuoka, 1969; из фекалий свиней, цыплят, КРС, крыс и мышей
12. В. cuniculi (Б. куникули)	Cuniculi - Кроличий (от кролика)			64; В. globosum -50 -67%; В. animalis - 26 -31%; В. pullorum - 25 %; В. thermophilum -15-25 %; В. adolescentis - 25%	Scardovi, Trovatelli, Biavati, Zani, 1979; из фекалий кролика
13. В. choerinum (Б. хоеринум)	Choerinum - принадлежащий свинье (от свиньи)			66; В. pseudolongum - 45-50 %; В. pullorum - 37 %; В. indicum - 44 %; В. globosum - 50 %; В. asteroides - 50 %	Scardovi, Trovatelli, Biavati, Zani, 1979; из фекалий поросят, из сточных вод
14. В. animalis (Б. анималис)	Animalis - Животный (от животных)			60; В. pullorum - 35 %; В. adolescentis - 30%; В. globosum - 40 %; В. cuniculi - 18-25 %	Mitsuoka, 1969; из фекалий крыс, цыплят, кроликов, телят, овец, свиней; из сточных вод
15. В. thermophilum (Б. термофилюм)	Thermophilum теплолюбивый		Рибофлавин, Пантотенат кальция, пиридоксин	60; В. choerinum- 15- 35%; В. bourn - 36-74 %; В. longum - 27-80 %	Mitsuoka, 1969; из фекалий свиней, поросят, цыплят, телят, рубца КРС, сточных вод
16. В. bourn (Б. боум)	Bourn – от Крупного рогатого скота			60; В. thermophilum - 27-80 %; В. adolescentis - 25%	Scardovi, Trovatelli, Biavati, Zani, 1979; из рубца КРС, фекалий поросят
17. В. magnum (Б. магнум)	Magnum - большой, огромный			60; В. globosum-32%; В. longum-0-29%; В. minimum - 19 %	Scardovi, Zani, 1974; из фекалий кроликов
18. В. pullorum (Б. пуллорум)	Pullorum - цыплячий (от цыплят)		Никотиновая кислота, пиридоксин, тиамин, фолиевая кислота, р-аминобензойная кислота, твин-80	67; В. adolescentis - 21%; В. bifidum - 20 %; В. breve-18 %	Trovatelli, Crociani, Pedinotti, Scardovi, 1974; из фекалий цыплят
19. В. suis (Б. суис)	Suis свиной		Рибофлавин	62; В. catenulatum - 25%; В. seudolongum - 9-27 %; В. angulatum - 20 %; В. dentium - 20 %; В. animalis - 20 %	Matteuzzi, Crociani, Zani, Trovatell, 1971; из фекалий поросят
20. В. minimum (Б. минимум)	Minimum наименьший			61,5; В. globosum - 33 %; В. catenulatum - 30%; В. subtile-10-31%; В. angulatum - 23 %	Biovati, Scardovi, Moore, 1982; из сточных вод
21. В. subtile (Б. субтиле)	Subtile - тонкий, стройный			61,5; В. longum - 23 %; В. minimum - 16 - 20%; В. breve-17%	Biovati, Scardovi, Moore, 1982; из сточных вод
22. В. coryneforme (Б. коринеформе)	Coryne - булава; forme форма; coryneforme - булавовидный			В. indicum-60%	Scardovi, Trovatelli, 1969; из кишечника медоносной пчелы Apis mellifera subsp. caucasica в Норвегии
23. В. asteroides (Б. астероидес)	Asteroides - звездоподобный		Рибофлавин, пантотенат кальция, никотиновая кислота, пиридоксин, тиамин, биотин	59; В. indicum - 23 - 30%; В. corineforme - 23%; В. choerinum - 50 %	Scardovi, Trovatelli, 1969; из кишечника медоносной пчелы Apis mellifera var. Ligustica в Италии
24. В. indicum (Б. индикум)	Indicum - от названия пчелы Apis indicum			60; В. coryneforme - 30%; В. subtile - 60 %	Scardovi, Trovatelti, 1969; из кишечника медоносной пчелы Apis indicum в Малайзии

кукурузного экстракта, цистеина и др.). На плотных питательных средах бифидобактерий образуют разнообразные колонии: плоские, полушаровидные, блестящие, шероховатые, окруженные валиком, имеющие более темный центр и т.д. Цвет колоний изменяется от белого и серого до темно-коричневого. Колонии часто напоминают по форме зерно гречихи или усеченную треугольную пирамиду, на некоторых средах колонии имеют форму чечевичек. Размеры колоний от 0,5 до 5 мм.

В молоке бифидобактерий развиваются медленно, так как коровье молоко не является естественной средой их обитания. Одной из причин плохого роста бифидобактерий в молоке служит растворенный в нем кислород. У них не обнаружено казеолитической активности, т.е. они могут усваивать казеин только после частичного гидролиза. В результате расщепления казеина образуются полипептиды, гликопептиды, аминосахара, стимулирующие рост бифидобактерий. Другой причиной заторможенного роста бифидобактерий может быть и их низкая фосфатазная активность.

Рост бифидобактерий в коровьем молоке стимулируют экстракты дрожжей, гидролизованное молоко, а также увеличение соотношения белок : лактоза. Сильный стимулирующий эффект роста бифидобактерий получают при использовании гидролизатов казеина.

Растительными стимуляторами роста бифидобактерий в молоке являются обезжиренная соя, экстракт картофеля, тростниковый сахар, кукурузный экстракт, морковный сок. В качестве стимуляторов роста применяют также соли железа, сорбит, микроэлементы в виде сернокислой меди и лактата железа.

Одним из способов активации роста бифидобактерий в молоке является получение мутантов этих микроорганизмов, способных расти без какой-либо защиты от кислорода.

Для культивирования бифидобактерий наиболее распространенной считается печеночно-цистеиновая среда (среда Блаурока).

Для ее приготовления 500 г говяжьей печени, освобожденной от сухожилий, пропускают через мясорубку, заливают двойным количеством воды и кипятят в течение 2 ч, затем отфильтровывают. Фильтрат доводят дистиллированной водой до 1000 см³ и вносят 10 г пептона, 10 г лактозы, 100 мг хлористого цистеина, 5 г NaCl и агара 1-2 г. рН среды 6,8-7,0. Однако эта среда дорога, содержит дефицитные компоненты, поэтому мало пригодна для использования в промышленных условиях.

В молочной промышленности для выявления бифидобактерии рекомендована гидролизатно-молочная среда (ГМ-среда). Для ее приготовления в небольшом количестве разведенного гидролизованного молока (гидролизата) расплавляют агар из расчета 2,5 г. на 1 дм³ приготовленной среды. К остальному количеству гидролизата добавляют 20 г. пептона и 3,5 г. хлористого натрия, смесь нагревают до температуры 80 °С, после чего соединяют с расплавленным агаром. Устанавливают рН 7,5 и смесь кипятят в течение 15 мин, дают отстояться, сливают с осадка, не фильтруя, доливают горячей дистиллированной водой до заданного объема и добавляют в нее 10 г. лактозы и 0,15 г. солянокислого цистеина. Среду разливают в пробирки высоким столбиком по 10 см³ и стерилизуют при температуре 112 °С в течение 30 мин.

Биохимические свойства. Бифидобактерии являются хемоорганотрофами, активно сбраживают сахарозу, галактозу, фруктозу, мальтозу, мелибиозу, раффинозу, лактозу и др. (таблица 16), с образованием в основном уксусной и молочной кислот в молярном соотношении 3:2. Образуются также примеси муравьиной и янтарной кислот, а также этанола. Масляную, пропионовую кислоты и СО₂ не образуют.

Бифидобактерии не продуцируют каталазы, не образуют индол и сероводород, не восстанавливают нитраты, не разжижают желатин. Они не продуцируют фенол, не образуют аммиак из аргинина. При развитии в лакмусовом молоке бифидобактерии вызывают частичное или полное его восстановление. Эти микроорганизмы способны развиваться в бульоне из гидролизованного молока с 2%-ным раствором поваренной соли, 20 % желчи, концентрацией фенола 1 : 250. Цитраты в качестве источника энергии бифидобактерии не используют.

Большинство штаммов бифидобактерии не сквашивают стерильное молоко или сквашивают его через 4 сут и более. В процессе культивирования биохимическая активность микробов повышается и свертывание молока происходит через 24-36 ч. Биохимическая активность повышается также при добавлении в молоко ростовых веществ. При внесении 5-10 % посевного материала сквашивание наблюдается через 8-12 ч. Предельная кислотность достигает 120-130 ° Т.

Кроме кишечника теплокровных бифидобактерии обнаружены в ротовой полости, также у насекомых и в сточных водах.

Бифидобактерии применяют при изготовлении кисломолочных продуктов для детей раннего возраста и пробиотиков для людей и животных, так как способствуют нормализации микрофлоры кишечника. Они сообщают продукту диетические и лечебные свойства, так как синтезируют витамины группы В (B1, B2, В6, В12, фолиевую кислоту), витамин К, также незаменимые аминокислоты, при этом в качестве азота используют аммиак. Эти микроорганизмы разрушают канцерогенные вещества, образуемые некоторыми представителями кишечной микрофлоры при азотном обмене, выполняя, таким образом, роль «второй печени».

Бифидофлора играет важную роль в жизнедеятельности человека, поддерживая его здоровье на оптимальном уровне. Она является преобладающей микрофлорой в кишечнике. В 1 г. содержимого толстого кишечника взрослого человека обнаруживают несколько миллиардов клеток бифидобактерии.