10. Иммунитет

Иммунитет после перенесенно­го заболевания напряженный и длительный. Вырабатываются иммуноглобулины, обладающие протективными свойствами. Они активируют фагоцитарную реакцию организма, способствуют лизису бактерий. Титр АТ начинает возрастать со 2 недели — используется в серодиагностике. Протективный иммунный ответ обеспечи­вается синергичным действием клеточного иммунного ответа, в котором ведущая роль принадлежит активированным макрофагам.

Гуморальный иммунитет самостоятельно не обладает протективной активностью, а явля­ется свидетелем инфекционного процесса. Причем первыми к концу 1-й недели заболе­вания появляются антитела к О-антигену, ко­торые максимальных титров достигают к раз­гару заболевания, а затем исчезают. Антитела к Н-антигену появляются в период реконвалесценции и у привитых лиц и длительно со­храняются. У бактерионосителей брюшного тифа обнаруживаются антитела к Vi-антигену. Возникновение бактерионосительства связано с функциональной недостаточностью макрофагов.

11. Методы лабораторной диагностики

На основании знания патогенеза брюшного тифа и паратифов проводят лабораторное исследование: на 1-й неделе заболевания выделяют гемокультуру, а начиная с 3-й недели — копрокультуру. Серологическое исследование с целью обнаружения специфичес­ких антител в сыворотке больного проводят, начиная со 2-й недели заболевания с помощью различных серологических реакций.

Таким образом, основными методами лабораторной диагности­ки являются бактериологический и серологический.

Основной метод — бактериологический. Исходя из патогенеза оптимальным срокам бактериологических исследований при гастроинтестинальных формах являются первые дни, при генерализованных формах — конец второй — начало третьей недели заболевания. При исследовании различных материалов (испражнения, кровь, моча, желчь, рвотные массы, пищевые остатки) наибольшая частота положительных результатов отмечается при исследовании испражнений, для возбудителя брюшного тифа и паратифов — крови (гемокультура).

Бактериологическую диагностику проводят поэтапно, как указано в таблице 16.

На 1-й неделе заболевания исследуют кровь с целью выделения возбудителя. Гемокультуру выделяют в 100% случаев заболевания. Примерно у 40% заболевших удается выделить гемокультуру и на 2-й неделе заболевания при условии посева 15-20 мл крови. Кровь берут из локтевой вены в объеме 10 мл и засевают в колбу со 100 мл жидкой питательной среды (среды обогащения для "чистого" материала — среда Раппопорт или желчный бульон). Следует соблюдать соотношение крови и питательной среды не менее 1:10, чтобы не проявилось бакте­рицидное действие крови. Далее делают высев со среды обогащения на чашку со средой Эндо, где в положительном случае вырастают лактозонегативные (лак-) колонии — бесцветные или бледно-розовые по­лупрозрачные колонии. Колонии засевают в комбинированные дифференциально-диагностические среды (Клиглера, Ресселя и др.). Выделенную лактозонегативную культуру идентифицируют на осно­вании изучения биохимических и антигенных свойств. Биохимическое тестирование проводят на различных дифференциально-диагностических средах или более совершенными методами — в системе API 20 Е, с помо­щью энтеротестов, Enterotube и др. Для идентификации культур в РА используют поливалентные и моновалентные О-, Н-и Vi-антисыворотки. Сначала используют поливалентные адсорбированные О-и Н-сыворотки, а затем при положительном результате — соответствующие моновалентные О-и Н-сыворотки. Для идентификации возбудителей брюшного тифа и паратифов используют антитела к антигену О2 (S.paratyphi A), O4 (S.paratyphi B), O9 (S.typhi). Если культура не агглютинируется О-сывороткой, ее нужно исследовать с Vi-сывороткой. Для быстрого выявления сальмонелл используют поливалентные люминесцентные сыворотки.

С 3-й недели заболевания (нередко с конца 2-й) проводят повтор­ные высевы возбудителя из испражнений. Со 2-й недели заболевания возможно выделить возбудителя также из мочи, желчи, соскоба из ро­зеол, костного мозга, но, практически, это делают редко. Бактериоло­гическое исследование испражнений несколько отличается от исследования крови, поскольку этот материал содержит посторон­нюю микрофлору. Пробу испражнений разводят в десять раз физиоло­гическим раствором NaCl и далее надосадочную жидкость в соотношении 1:5 засевают на среды обогащения (среды, предназна­ченные для посева загрязненных материалов — селенитовый бульон или среду Мюллера). Затем делают пересев на чашки со средами Эндо, Плоскирева. или висмут-сульфит агаром. На двух последних значи­тельно подавляется рост посторонней микрофлоры, что способствует выделению возбудителя.

Как правило, одновременно с посевом на среды обогащения, про­бу испражнений засевают непосредственно на чашки со средами Плос­кирева или висмут-сульфит агара. Если на них вырастают колонии возбудителя, срок бактериологического диагноза становится на сутки короче. Выросшие подозрительные колонии — лактозонегативные на средах Эндо и Плоскирева и черные или коричневые на висмут-сульфит агаре — отсевают на комбинированные среды Клиглера, Ресселя и др., т.е. дальнейшее выделение чистой культуры возбудителя и его идентификация проводится так же, как и при исследовании кро­ви.

Таблица 16. Бактериологическое исследование крови больного при брюшном тифе, паратифе А и паратифе В па 1-й неделе заболевания (выделение гемокультуры)

Этап исследования	Ход исследования	Результат
Предварительный этап	Посев крови больного в колбу со средой Раппопорт	Среда Раппопорт помутнела, покраснела
1-й день	Высев со среды Раппопорт на чашки со средой Эндо для получения изолированных колоний	На среде Эндо выросли изолированные бесцветные колонии — лактозонегативные
2-й день	Пересев лак-колонии на комбинированную среду Ресселя или Клиглера — уколом в столбик, штрихом по скошенной поверхности среды Часть колонии засевают на тест-систему API 20 Е (приготовив предварительно суспензию)	Столбиковая часть комбинированной среды окислилась, скошенная поверхность имеет нейтральный или щелочной рН. В столбике могут быть пузырьки газа. При образовании Н2S среда Клиглера чернеет.
3-й день	Идентификация выделенной чистой культуры: 1. Изучение морфологических свойств в мазке, окрашенном по Граму; 2. Учет результатов биохимического тестирования; 3. Серологическая идентификация: -Реакция агглютинации на стекле с поливалентной сальмонелезной О-сывороткой (рецепторы 2.4,9); -Реакция агглютинации на стекле с монорецепторными О-сыворотками (сыворотки О-2. О-4, О-9) для определение серогруппы; -Реакция агглютинации на стекле с монорецепторными Н-сыворотками для определения вида (серовара). -Постановка опыта фаготипирование -проверка чувствительности культуры к антибиотикам методом бумажных дисков.	1.B поле зрения — беспорядочно расположенные небольшие грамотрицательные полочки с закругленным и концами; 2. Биохимическая характеристика выделенной культуры соответствует….. А.При положительной реакции — культура относится к роду Salmonella (серогруппе А, В или D); Б. При положительной реакции с О-сывороткой — культура относится к …. серогруппе В. При положительной реакции с Н-сывороткой культура относится к виду… 4. Культура относится к фаготипу .... 5. Учет чувствительности к антибиотикам
4-й день	Учет результатов идентификации и заключение по проведенному исследованию.	Заключение: из крови больного выделена культура….. типичная по свойствам и чувствительная к антибиотикам ……

Серологические исследования проводят для диагностики, а также выявления и дифференциации различных форм носительства. Применяют РА (реакцию Видаля) с О-и Н-диагностикумами и РПГА с применением поливалентных эритроцитарных диагностикумов, содержащих полисахаридные антигены серогрупп А,В,С,Д и Е и Vi-антиген.

Серологическая идентификация сальмонелл проводится в ре­акции агглютинации на стекле с агглютинирующими адсорбирован­ными сальмонеллезными О-и Н-сыворотками. Такие сыворотки получают методом адсорбции антител по Кастеллани из видовых им­мунных сывороток (путем насыщения сыворотки родственными бак­териями, на которых адсорбируются группоспецифические антитела). Агглютинирующие адсорбированные сальмонеллезные сыворотки мо­гут быть поливалентными и монорецепторными, т.е. содержать не­сколько различных антител (рецепторов) или только один.

Последовательность серологической идентификации выделенной культуры:

Для установления принадлежности культуры к роду Salmonella, а именно к наиболее распространенным серогруппам — А, В, С. D, Е — культуру испытывают в реакции агглютинации с адсор­бированной поливалентной О-сывороткой, содержащей антите­ла против антигенных рецептеров 2, 4, 7, 9, 3, 10. При необходимости используют монорецепторные О-сыворотки про­тив редких серогрупп. При диагностике брюшного тифа, пара­тифа А и паратифа В можно использовать смесь О-сывороток, содержащих антитела к рецепторам 2, 4, 9.

При положительном результате для определения принадлежно­сти испытуемой культуры к определенной серологической группе ставят реакцию агглютинации раздельно с каждой монорецепторной О-сывороткой, входившей в состав поливалентной: ре­цептор 2 (серогруппа А), рецептор 4 (серогруппа В), рецептор 7 (серогруппа С), рецептор 9 (серогруппа D) и т.д.

После установления серогруппы, к которой относится культура, определяют ее видовую принадлежность (серовариант) с помо­щью реакции агглютинации с адсорбированными монорецептор­ными Н-сыворотками против Н-антигенов 1 - и фазы сальмонелл, входящих в состав данной серогруппы. Далее проводят реак­цию агглютинации с адсорбированными Н-сыворотками против Н-антигенов 2-й фазы и окончательно устанавливают антиген­ную формулу испытуемой культуры.