11. Методы лабораторной диагностики

Основной метод диагностики стафилококковых инфекций бактериологический. Из исследуемого материала готовят мазки для первичной бактериоскопии, окрашивают по методу Грама и микроскопируют. Наличие в препаратах грамположительных кокков, располагающихся в виде гроздьевидных скоплений, позволяет поставить предварительный диагноз стафилококковой инфекции. Однако в патологическом материале стафилококки редко образуют типичные скопления, а располагаются поодиночке или небольшими группами.

Посев исследуемого материала проводят на кровяной агар и желточно-солевой агар для получения изолированных колоний. Посевы инкубируют при 37°С в течение суток (табл. 1).

Таблица 1. Схема бактериологического метода диагностики стафилококковых инфекций

1 день	1. Ориентировочная бактериоскопия окраска по Граму: гроздьевидные скопления грам(+) кокков 2. Посев на желточно-солевой агар и кровяной агар с целью получения изолированных колоний
2 день	1. Изучение культуральных свойств (мутные круглые ровные колонии средних размеров кремового, желтого или оранжевого цвета) ЖСА: при наличии лецитиназы вокруг колоний образуются зоны помутнения с перламутровым оттенком (опалесценция); Кровяной агар: при наличии гемолизина вокруг колоний образуются зоны α-и ß-гемолиза; 2. Приготовление мазка, окраска по Граму и изучение морфологических и тинкториальных свойств: гроздьевидные скопления грам(+) кокков 3. Пересев на скошенный агар с целью получения чистой культуры
3-4 день	1. Определение чистоты выделенной чистой культуры макроскопически и микроскопически 2. Идентификация выделенной чистой культуры по морфологическим и тинкториальным свойствам: гроздьевидные скопления грам(+) кокков культуральным свойствам: мутные круглые ровные колонии средних размеров кремового, желтого или оранжевого цвета (признаком патогенности стафилококков является образование золотистого или желто-лимонного пигмента биохимическим свойствам (см.табл 2) факторам патогенности (наличие плазмокоагулазы, лецитиназы, гемолизина и др.) фаготипу (фагоидентификация) 3. Определение чувствительности выделенной чистой культуры к антибактериальным препаратам. Особое значение для идентификации стафилококков с высокими вирулентными свойствами и множественной устойчивостью к антибиотикам имеет оценка резистентности к метициллину (MRSA-стафилококки).

На следующий день изучают культуральные свойства. Стафилококки образуют мутные круглые ровные колонии средних размеров кремового, желтого или оранжевого цвета (S-формы). Для определения гемолитической активности выявляют зону полного (β-гемолиза) и неполного (α -гемолиза). Гемолитические свойства бактерий связаны с наличием гемолизина (экзотоксина, мембранотоксина по механизму действия). Лецитиназную активность (способность продукции экзофермента лецитиназы) определяют на желточно-солевом агаре. Вокруг колоний стафилококков, обладающих лецитиназной активностью образуются зоны опалесценции (помутнения с перламутровым блеском). Для последующей идентификации проводят накопление чистой культуры на скошенном агаре. Для постановки реакции на плазмокоагулазу плазму крови, разведенную в 2 раза, разливают по 0,4 мл в пробирки, вносят одну петлю испытуемой культуры стафилококка и помещают в термостат при 37°С. Оценивают результат через 1, 2, 4 и 24 часа. При наличии плазмокоагулазы происходит свертывание плазмы с образованием сгустка фибрина (гель). Плазмокоагулазная активность является основным идентификационным признаком S.aureus.

Для определения ферментации маннита в анаэробных условиях с целью внутривидовой идентификации (табл. 2) используется дифференциально-диагностическая среда, содержащая маннит и индикатор. При расщеплении маннита образуются кислые продукты, изменяющие цвет индикатора в среде (индикатор Андреде — красная окраска, индикатор ВР — синяя).

Таблица 2. Дифференциальные признаки стафилококков

Признак	Вид
	S.aureus	S.epidermidis	S.saprophyticus
Наличие липохромного пигмента	+/-	-	+
Образование плазмокоагулазы	+	-	-
Образование лецитиназы	+	-	-
Гемолитическая активность	+	-	-
Ферментация маннита в анаэробных условиях	+	-	+
Ферментация углеводов в аэробных условиях: глюкозы сахарозы лактоза трегалоза фруктоза	+ + + + +	+ + +/- - +	- + +/- + +
Чувствительность к новобиоцину	S	S	R
Примечание: (+) — наличие признака, (-) –отсутствие признака, S — чувствительный, R — резистентный.

Для проведения фагоидентификации используют международный набор фагов (21 тип). Исследуемую культуру засевают в чашки Петри методом газона, подсушивают и наносят каплю фага, предварительно расчертив дно чашки на квадраты. Используют группоспецифические бактериофаги (поливалентные) с целью определения фагогруппы, а затем определяют фаготип с помощью моновалентных бактериофагов.

Важным этапом бактериологического анализа является изучение чувствительности к антибактериальным препаратам с использованием различных методик (диско-диффу-зионный метод, метод серийных разведений, Е-тест).

Для экспресс-идентификации применяют тест латекс-агглютинации с использованием коммерческих частиц латекса, нагруженных антителами, например, «Staphylatex» American Bioscan. Для биохимической идентификации используют системы аpi Staph (bio Mērueux).

Серологические исследования не имеют принципиального значения, а результаты часто носят противоречивый характер, что связано со сложной антигеннной структурой этого микроорганизма. Иногда для типовой идентификации энтеротоксинов проводят реакцию преципитации в геле со специфическими сыворотками.

Иммунохимические исследования основаны на обнаружении антигенов (ферментов и токсинов) возбудителя в материале от больного с помощью чувствительных серологических реакций.

Молекулярно-генетические методы исследования позволяют выявить ДНК возбудителя в исследуемом материале методом ПЦР.