8. Факторы патогенности

1. Эндотоксин M. pneumoniae проявляет пирогенный эффект, вызывая тромбогеморрагические поражения, коллапс и отек легких.

2. Продукция токсина β-гемолизина — важнейший фактор патогенности, M. pneumoniae обладает способностью к гемадсорбции и гемолизу.

3. Предполагают наличие нейротоксина у некоторых штаммов M pneumoniae, так как часто инфекции дыхательных путей сопровождают поражения нервной системы.

4. Факторы адсорбции (терминальные структуры и микрокапсула.)

9. Патогенез

Адсорбция M. pneumoniae — сложный процесс, в котором огромную роль играют именно терминальные структуры и микрокапсула возбудителя, обеспечивающие настолько тесный межмембранный контакт, что невозможно исключить прямое проникновение содержимого микоплазм в клетку. Именно этим путем клетки хозяина превращаются в иммунологически чужеродные, вызывающие образование к ним антител. Предполагается, что именно с формированием аутоантител связано развитие нереспираторных проявлений этой инфекции.

При воздушно-капельном пути передачи микоплазма вызывает поражение слизистых оболочек задней стенки глотки, трахеи, бронхов. Но основные изменения происходят за счет адгезинов в альвеолярном эпителии. В системе клеток мерцательного эпителия прикрепление происходит слабее, что, по-видимому, обусловлено активностью ресничек. Все же достаточная доза патогенного штамма M. pneumoniae вызывает дисфункцию ресничек, вплоть до цилиостаза, затем происходит их цитоадсорбция и встраивание участков мембраны возбудителя в мембрану клеток. Мембранная интеграция сопровождается нарушением макромолекулярного синтеза. Альвеолярные макрофаги и нейтрофилы осуществляют фагоцитоз, и этот процесс сопровождается слущиванием резко измененных альвеолярных клеток, экссудацией внутриклеточной жидкости.

10. Иммунитет

Специфической резистентности после перенесенного заболевания не формируется, возможны случаи повторного заражения. Фагоцитоз незавершенный, при отсутствии антител макрофаги не способны фагоцитировать микоплазмы, что обусловлено наличием микрокапсулы и поверхностных Аг.

11. Методы лабораторной диагностики

1. Культуральное исследование с выделением и идентификацией микоплазм (с количественной оценкой) является "золотым стандартом" диагностики. Точность выявления достигает 100%;

2. Для серодиагностики инфекции определяют специфические антитела в парных сыворотках больного, диагностическое значение имеет увеличение титра антител в 4 раза и более.

3. Обнаружение антигена в мокроте с использованием реакции иммуноферментного анализа (ИФА) с обнаружением специфических IgG и IgM. ИФА демонстрирует высокую чувствительность и специфичность 92% и 95% соответственно. Время сероконверсии, т.е. четырехкратного возрастания титра антимикоплазменных антител при последовательном исследовании проб крови, взятых в остром периоде заболевания и в периоде реконвалесценции, обычно составляет 3-8 недель.

4. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Для проведения этой реакции из исследуемого материала выделяют ДНК, в которой определяют наличие специфичного для данного микроба гена. ПЦР основан на амплификации, т.е. увеличении количества копий специфического (маркерного) гена возбудителя. Для этого двунитевую ДНК, выделенную из исследуемого материала, денатурируют (“расплетают” при нагревании) и достраивают, при охлаждении, к расплетенным нитям ДНК новые комплементарные нити, в результате чего из одного гена образуются два. Этот процесс копирования генов многократно повторяется при заданных температурных режимах. Достраивание новых комплементарных нитей ДНК происходит при добавлении к искомым генам праймеров (затравки из коротких однонитевых ДНК, комплементарных 3’-концам ДНК искомого гена), ДНК-полимеразы и нуклеотидов. Денатурация (разрыв водородных связей и трансформация двухцепочечной ДНК в одноцепочечные) осуществляется при температуре 93-95ºC в течение 1-3 минут. Присоединение (отжиг) праймеров (олигонуклеоитидные генетические затравки) происходит комплементарно к соответствующим последовательностям специфического фрагмента на противоположных нитях ДНК. Температура отжига является специфической для каждой пары праймеров и располагается в интервале 50-65 ºC. Точно рассчитанная и экспериментально проверенная величина температуры отжига праймеров является одной из определяющих специфичность реакции характеристик, исключающих присоединение праймеров к не полностью комплементарным последовательностям.

Комплементарное достраивание цепей ДНК (синтез фрагмента). Присоединившиеся праймеры формируют стартовые блоки, с которых начинается синтез ДНК. Комплементарное достраивание нитей ДНК всегда протекает только в направлении от 5'-конца к 3'-концу нити ДНК и происходит в противоположных друг другу направлениях. Образовавшиеся в первом цикле амплификации продукты синтеза служат матрицами для второго цикла амплификации, в результате которого, собственно, и происходит образование искомого специфического фрагмента ДНК. Начиная с третьего цикла амплификации вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синетза новых нитей в следующем цикле амплификации — это и есть цепная реакция в ПЦР. Температура синтеза ДНК 72 ºC, время -3 мин.

Построение новых нитей ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов (дНТФ) осуществляет термостабильная ДНК-полимераза, т.н. Taq-полимераза в присутствии ионов магния и Tris-HCl — буфера, которые создают необходимые условия для функционирования фермента.

В результате 30-45 циклов амплификации синтезируются ≈10⁸ копий фрагмента, что делает возможным визуальный учет результатов после электрофореза в агаровом (полиакриламидном) геле. Использование термостабильной ДНК-полимеразы позволило автоматизировать процесс амплификации с помощью специального прибора, называемого термоциклером или амплификатором. Этот прибор автоматически осуществляет смену температур согласно заданной программе и числу циклов амплификации.

5. Реакция связывания комплемента (РСК) демонстрирует вариабельную чувствительность (50-90%) и субоптимальную специфичность.

6. Тест холодовой агглютинации ввиду его низкой чувствительности и специфичности в настоящее время в клинической практике не используется.