Флуориметрия

Флуориметрия - один из методов люминесцентного анализа, построенный на измерении интенсивности флуоресценции.

Флуоресценцией называют свечение, возникающее под влиянием электромагнитного излучения на некоторые вещества и прекращается после удаления источника излучения. Под влиянием кванта этого излучения hv₀ молекулы и атомы переходять в возбужденное состояние. Через некоторый промежуток времени 10^-12 с молекулы возвращаются в основное состояние.

При этом происходит излучение энергии в виде кванта теплового излучения hv_Т, что приводит к стабилизации молекулы на нижнем возбужденном уровне, а затем происходит излучение кванта hv вследствие возвращения молекулы в основное состояние. Таким образом, энергия (частота) флуоресцентного излучения должна быть меньше, чем энергия (частота) возбуждающего излучения hv₀

hv = hv₀ - hv_T

Это явление было открыто Стоксом и назван законом Стокса. В соответствии с этим законом спектр флуоресценции и его максимум всегда сдвинуты относительно спектра поглощения и его максимума в сторону длинных волн (рис. 1.8.1).

Поэтому вещества, поглощающие ультрафиолетовое излучение, способны флуоресцировать любым светом; вещества, флуоресценция которых возбуждается светом в видимой области, дают свечение, которое расположено в более длинноволновой области спектра. Расстояние между максимумом спектра поглощения и максимумом спектра флуоресценции называют стоксовым смещением. Чем оно больше, тем надежнее определение вещества флуоресцентным методом.

Рис. 1.8.1. Зеркальная симметрия спектров веществ, которые флуоресцируют:

1 – спектр поглощения; 2 – спектр излучения,

Е_в – энергия излучения, λ – длина волны

Отношение числа квантов, которые излучаются возбужденной молекулой N_B, к числу квантов, которые поглощаются N_П, называют квантовым выходом В_к

Отношение величин энергии, которая излучается Е_В, и энергии, которая поглощается Е_П, называют энергетическим выходом В_е

Благодаря тому что энергия кванта Е связана с частотой v и длиной волны λ соотношением:

где h — постоянная Планка; с — скорость распространения света, можно показать зависимость между энергетическим выходом В_е и квантовым выходом В_К как:

Флуоресценция может быть применена как для количественного, так и качественного анализа. Во многих случаях спектральные характеристики флуоресценции органических веществ позволяют идентифицировать эти соединения по их спектрам. В простейшем случае качественное определение веществ может быть проведено по цвету флуоресцентного излучения.

Количественный люминесцентный анализ основан на зависимости интенсивности флуоресценции растворов от концентрации флуоресцирующего вещества. В диапазоне концентраций 10^-7 - 10^-4 моль/дм³ эта зависимость носит линейный характер и описывается уравнением :

F = I₀ · 2,3ε b · c · φ,

где F — интенсивность флуоресценции, квант · с^-1; I₀ — интенсивность возбуждающего света, квант · с^-1; ε — молярний коэффициент поглощения; b — толщина флуоресцентного слоя, см; с — концентрация раствора, моль/дм³; φ — квантовый выход флуоресценции, который зависит от природы вещества.

При условии, что I₀, ε, b, φ — постоянные величины, уравнение принимает вид:

F= K·c

где К  константа.

Интенсивность флуоресценции существенно зависит от:

- природы вещества;

- температуры (в большинстве случаев с повышением температуры выход и интенсивность флуоресценции уменьшаются - температурное тушение флуоресценции);

          - РН среды (зависимость носит сложный характер);

          - присутствия в растворе побочных веществ (тушение флуоресценции).

Количественный флуоресцентный анализ следует проводить при невысоких температурах и определенных значениях рН. Метод применяется при определении малых концентраций неорганических и органических веществ: антибиотиков, витаминов, гормонов и др.

Тушение люминесценции. Явление тушения люминесценции базируется на том, что при увеличении концентрации разбавленных растворов вещества люминесценция возрастает сначала пропорционально концентрации, а далее увеличение интенсивности люминесценции «отстает» от увеличения концентрации. Так, при увеличении концентрации флуоресцеина от 0,0003 до 0,003 М интенсивность люминесценции возрастает почти до 10 раз. Однако, например, в 1% растворе люминесценция флуоресцеина слабее, чем в очень разбавленных растворах. Такие явления были отмечены давно для многих веществ. Позже было показано, что аналогичный эффект резкого ослабления люминесценции флуоресцеина и других веществ иногда вызван добавками значительных количеств таких веществ, как, например, йодид калия, которые в данных условиях не реагируют с люминесцирующим веществом.

Тушение люминесценции по С.И.Вавилову может быть двух родов. Тушение люминесценции, вызванное процессами, связанными с внутренними молекулярными перегруппировками, которые могут происходить даже в тех случаях, когда молекулы находятся в невозбужденном состоянии, относят к первому роду. В этом случае тушение не сопровождается уменьшением продолжительности после свечения. Тушение первого рода является причиной того, что при химическом процессе люминесцирующее вещество превращается в вещество, которое не люминесцирует. Таким образом, тушение первого рода сопровождается изменением внутреннего молекулярного взаимодействия составляющих частей молекул и, как следствие, изменением спектров поглощения и люминесценции.

Тушение второго рода не сопровождается изменением спектров поглощения и люминесценции. Такой процесс происходит вследствие воздействия на возбужденную молекулу внешних факторов , но эти факторы не приводят к образованию нового вещества.

Наблюдается также концентрационное тушение, которое может привести к получению ложных результатов в люминесцентном анализе. Причины тушения разнообразны, их физико-химическая природа не всегда объяснима.

Комбинированные методы флуориметрии. Особый интерес для аналитической химии имеет метод объемного титрования с использованием люминесцентных индикаторов. Сочетание люминесцентного и хроматографического методов используется в люминесцентной хроматографии.

При анализе растворов, содержащих примеси, которые мешают определению, исследуемое вещество экстрагируют органическим растворителем. Этот способ используют и в том случае, когда в результате фотометрической реакции получают малорастворимые в воде, но хорошо растворимые в органических растворителях комплексные соединения. Исследуемое вещество , способное к флуоресценции, выделяют экстракцией и определяют обычным способом. Этот метод анализа называют экстракционно - люминесцентным. Использование комбинированных методов флуориметрии и концентрирования позволяет существенным образом увеличить чувствительность анализа.