Фотометрия

Фотометрия построена на измерении поглощения немонохроматического света, проходящего через раствор, при помощи приборов, которые называются фотометрами (предыдущее название – фотоэлектроколориметры). Немонохроматическое излучение с узким диапазоном длин волн получают при помощи светофильтров. Интен­сивность немонохроматического излучения определяют по ве­личине тока, который возникает в фотоэлементе. Шкала этих приборов градуирована в величинах оптической плотности А и процентах пропускания Т. Связь между величинами А и Т выражают уравнением:

А= lgT

При разработке методик фотометрических определений следует учитывать ряд факторов:

— выбор светофильтров осуществляется таким образом, чтобы макси­мум поглощения раствора (максимум на кривой светлопоглощения) отвечал минимуму поглощения светофильтра;

— определение условий выполнения фотометрической реакции (рН, природа и количество реагента и другое), которые позволяют получать стойкие по времени и достаточно высокие значения оптической плотности.

Максимально правильные результаты при минимальной ошибке определения на фотометрах имеют место, когда оптическая плотность находится в интервале 0,2—0,7.

Методы, в которых используется монохроматическое излучение (спектрофотометрия)

Отличие этого метода от фотометрии состоит в том, что анализ осуществляют по поглощению веществами монохроматического излучения в видимой, УФ- и ИК-областях спектра.

Качественный анализ веществ по их спектрам поглощения прово­дят двумя способами:

—по известным параметрам спектра поглощения исследуемого вещества;

— сравнением спектров поглощения растворов стандартного вещества и раствора исследуемого вещества одного и того же состава.

Использование в анализе метода спектрофотометрии, как и других фотометрических методов, основано на использовании концентрации вещества при помощи закона Бугера—Ламберта—Бера. В отличии от фотометрических определений в спектрофотометрии можно анализировать не только окрашенные, но и бесцветные растворы. В последнем случае анализ проводят не в видимой, а в УФ- или ИК-областях спектра.

Спектрофотометрические методы по сравнению с фотометрическими позволяют решить более широкий круг вопросов:

—одновременное количественное определение нескольких компонентов многокомпонентных смесей;

— определение состава и констант устойчивости комплексных соединений;

— определение констант ионизации кислот, оснований и др.

Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях спектра

Поглощение в УФ- и видимой областях спектра поясняют наличием в молекуле вещества определенных групп – хромофоров, к которым могут быть отнесены двойные и тройные связи, ароматические фрагменты, азо-, нитро- и другие группы. Природа полос поглощения связана с электронными переходами в молекулах и ионах, которые поглощают свет (электронные спектры). Некоторые вещества для анализа необходимо сначала перевести в соединение, которое поглощает излучение. Спектрофотометрические измерения в ультрафиолетовой и видимой области спектра обычно проводят для растворов, хотя объектами исследований могут быть также вещества в парообразном, жидком и твердом состояниях.

Как растворители наиболее часто используют воду, спирты, хлороформ, углеводороды, эфиры, растворы щелочей или кислот, причем они не должны поглощать сами и содержат примеси, которые поглощают свет на данном участке спектра. На рис. 1.2.7 приведен УФ–спектр поглощения лекарственного вещества пироксикама. При 334 нм находится аналитическая полоса поглощения, которая используется для качественного определения пироксикама.

Рис. 1.2.7. УФ – спектр поглощения пироксикама

ИК-спектроскопия

Если молекула поглощает фотон с энергией меньше 80 кДж/моль, то этой энергии хватит лишь на изменение энергии колебаний атомов, но не на электронный переход, при этом молекула переходит из одного колебательного

состояния в другое, и соответственная спектральная линия лежит в ИК-области. Обычно для изображения ИК–спектров используют частоту, реже длину волны (в мкм). Интенсивность поглощения ИК–излучения, как правило, выражают величиной пропускания Т в процентах (рис. 1.2.8).

Различают несколько типов колебаний атомов в многоатомных молекулах: валентные (симметричные и антисимметричные) и деформационные разных видов. При валентных колебаниях изменяются длины связей (расстояния) между атомами, при деформационных колебаниях – угол между связями без изменений их длин.

Необходимым условием колебательного перехода является изменением дипольного момента молекулы при колебаниях атомов. Симметричная молекула, которая не имеет дипольного момента, не может поглощать ИК – излучение. Примеры таких молекул – двухатомные молекулы с ковалентной связью (H₂, N₂, галогены, молекула СО₂ с симметрично ковалентными колебаниями атомов и т.д.).

Рис. 1.2.8. ІК – спектр полистирола в шкале частот и длин волн

Колебательные переходы обязательно сопровождаются вращениями, поэтому колебательная спектральная линия преобразуется в полосу, которая состоит из многих линий, а ИК–спектр представляет собой набор полос поглощения аналогично тому, как электронный переход обязательно сопровождается колебательными и вращательными переходами, и электронный спектр состоит из полос поглощения. Ширина колебательных полос меньше электронных, поскольку разность энергий вращательных подуровней меньше, чем колебательных.

Каждый тип колебаний характеризуется определенной энергией возбуждения. Валентные колебания отвечают более высоким энергиям, чем деформационные, а, значит, полосы валентных колебаний лежат в более коротковолновой области.

Ориентировочно выделяют четыре области спектра: 2,7– 4,0 мкм – валентные колебания с участием атомов водорода (ОН, СН, NH, SН); 4,0–5,0 мкм – тройные валентные связи (С≡С, С≡N) и С=С=С; 5,0–6,4 мкм – двойные валентные связи (С=С, С=О, С=N) и группы –СООН, –СООR, –CONH₂; 6,0–15 мкм – одинарные валентные связи (С–Н, N–Н), группы –СН₃, –СН₂, –NH₂, группы с тяжелыми атомами и PO₄, SO₄, CO₃, NO₃.

В таблице приложения 2 приведены длины волн и частоты полос поглощения для некоторых наиболее известных связей и групп. Положение полос в спектрах вещества помагает установить наличие той или иной функциональной группы в соединениях. Но присутствие в молекуле других атомов может вызывать значнтельное смещение полосы. Таким образом, каждое соединение будет иметь свой характерный ИК-спектр («отпечаток пальцев»). На положение полосы могут влиять условия эксперимента (например, агрегатное состояние, растворитель) и условия регистрации спектра, поэтому отнесение полос поглощения к той или иной связи является сложной задачей. Неизвестное соединение идентифицируют, сравнивая его спектр со спектрами известных соединений, которые получены в тех же условиях. ИК-спектры большинства соединений зарегистрированны и собраны в специальных атласах, которыми пользуются при идентификации соединений и смесей веществ.

ИК–спектроскопия остается непревзойденным методом идентификации и исследования строения органических и некоторых неорганических соединений. Для многих лекарственных веществ Фармакопея предполагает использование ИК-спектроскопии как одного из методов идентификации.

При идентификации регистрируют спектр исследуемого вещества, выписывают частоты полос поглощения и оценивают их интенсивность в максимумах поглощения (минимумы полос на спектре в координатах Т – ν). Полученные данные сравнивают с табличными, пользуясь атласами спектров и учитывая возможные смещения полос. На рис. 1.2.9 приведен спектр поглощения лекарственного вещества парацетамола в ИК-области.

По ИК-спектрам можно судить и о составе смесей органических веществ.

Рис.1.2.9. ИК-спектр поглощения парацетамола в таблетках KBr