6.3. Основные принципы создания трансгенных растений

Одной из основ метода, позволившего осуществлять различные действия с генами, является использование ферментов, названных рест-рикционными эндонуклеазами, или рестриктазами. В настоящее время выделены рестриктазы, распознающие более 150 м'ест расщепле­ния ДНК. Эти ферменты способны распознавать определенную после­довательность своей ДНК и расщеплять «чужую» ДНК на мелкие фраг­менты. Такие фрагменты удобны для создания рекомбинантных ДНК.

Рекомбинантные ДНК - это ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из раз­личных биологических источников.

Сшивка фрагментов ДНК, полученных при помощи рестриктаз, производится тремя основными методами, зависящими от того, какие концы имеют фрагменты сшиваемых ДНК:

• сшивка по одноименным «липким» концам - любые два фрагмен­та ДНК, независимо от их происхождения, образовавшиеся под действием одной и той же рестриктазы, могут слипаться за счет об­разования водородных связей между однонитевыми участками комплементарных нуклеотидов;

• сшивка по «тупым» концам. Это менее эффективный метод, по­этому для получения рекомбинантных молекул ДНК пользуются «липкими» концами;

• сшивка фрагментов с разноименными «липкими» концами. Для связи разноименных, то есть некомплементарных друг другу «липких» концов, используют так называемые линкеры, или «переходники».

Линкеры - это химически синтезированные олигонуклеотиды, представляющие собой сайты рестрикции (места расщепления) или их комбинацию. Существуют большие наборы линкеров, в том числе «ту­пой конец - липкий конец». После того как ДНК сшита в пробирке, ее надо ввести в живые клетки и обеспечить стабильное поддержание ге­нетической информации. Это достигается при помощи так называемых векторных молекул, или векторов.

Векторными молекулами, или векторами, называют молекулы ДНК, способные акцептировать чужеродную ДНК и обеспечивающие ее репликацию и экспрессию.

Экспрессия гена - проявление генетической информации, запи­санной в гене, в форме рибонуклеиновой кислоты, белка и фенотипиче-ского признака.

Векторы позволяют осуществить введение в клетку дополнитель­ной генетической информации. В качестве векторов используют, как правило, плазмиды, бактериофаги и вирусы животных.

При создании трансгенных растений применяют природный ген­ный вектор, возникший в организме почвенных бактерий (Agrobacteria). Почти все двудольные растения чувствительны к агробактериям, а зла­ки и другие однодольные - нет.

В генной инженерии используют в основном почвенные бакте­рии Agrobacterium tumefaciens и Agrobacterium rhizogenes. В зависимо­сти от типа плазмиды 77 (в случае A. tumefaciens) либо Ri (в случае A. rhizogenes) они, попав в организм растения, начинают экспрессиро-вать чужеродные гены (онкогены), что приводит к образованию опухо­лей. Ученые научились «обезоруживать» 77- и Ri-плазмиды, заменяя онкогены в переносимой части плазмид (так называемая Т-ДНК) на те гены, которые необходимо ввести в растение. Один из способов введе­ния чужеродной ДНК заключается в использовании промежуточного вектора (рис. 47).

Рис. 47. Использование Ti-плазмиды в качестве вектора для переноса генов в растительные клетки [21]

Сущность этого способа состоит в следующем: Т-ДНК с по­мощью рестриктаз вырезают из плазмиды и вставляют в вектор для клонирования в Е. coli, например pBR 322. Плазмиду с Т-ДНК размно­жают и, используя стандартные методы, встраивают чужеродный ген внутрь Т-области и вновь размножают с уже вставленным геном. Затем полученную рекомбинантную плазмиду вводят в клетки A. tumefaciens, несущую полную 77-плазмиду. В результате двойной рекомбинации между гомологичными областями Т-ДНК часть рекомбинантной плаз­миды, которая содержит чужеродный ген, включится в Ti'-плазмиду, заместив в ней нормальную Т-ДНК. Бактериями, имеющими 77-плаз­миду со встроенными генами, заражают растения. В результате этого образуются опухоли - корончатый галл. Начинается перестройка мета­болизма клеток, которые будут содержать 77-область со встроенным в нее чужеродным геном.

Существуют и другие методы введения чужеродной генетической информации: применение бинарных векторов; векторов на основе ДНК-содержащих вирусов растений; прямого переноса генов.

Метод биологической баллистики является одним из самых эф­фективных на сегодняшний день методов трансформации однодольных. Сущность этого метода заключается в том, что на мельчай­шие частицы золота или вольфрама, диаметром 0,6-1,2 мкм, напыляется ДНК вектора, содержащего необходимую для трансформирования ген­ную конструкцию. Вольфрамовые или золотые частицы, несущие ДНК, наносятся на целлофановую подложку и помещаются внутрь биологиче­ской баллистической (биолистической) пушки. Они с огромной скоро­стью выбрасываются из биолистической пушки и, разрывая клеточные стенки, входят в цитоплазму и ядро клеток. Далее клетки осторожно пе­реносят на среду для дальнейшего культивирования и регенерации.

С помощью биолистической пушки были протрансформированы однодольные растения, такие как кукуруза, рис, пшеница, ячмень. При этом были получены стабильные растения-трансформанты.

Почвенная грамположительная бактерия Bacillus thuringiensis (Bt) продуцирует в процессе спорообразования кристаллические белко­вые включения.

Рис. 48. Специфичность действия Cry-белков на пищеварительные системы насекомых

Эти включения состоят из белков, называемых Cry-белками. Они обладают селективным действием против узких групп насекомых, при­чем различные классы белков эффективны для применения против раз­ных видов насекомых-вредителей. Cry-белки присоединяются к специ­фическим участкам клеток пищеварительной системы насекомых и об­разуют ионоселективные каналы в клеточных мембранах (рис. 48).

Рис. 48. Специфичность действия Cry-белков на пищеварительные системы насекомых

Из рисунка видно, каким образом протеины действуют на насеко­мых. Они распознают рецепторы ворсистого эпителия кишечника в пи­щеварительной системе контролируемого насекомого, в результате ряда реакций возникает перфорация клеток стенок кишечника. Это приводит к чрезмерному поступлению воды, клетки разбухают, что приводит к лизису и последующей гибели насекомого.

Bt-защищенные растения экспрессируют один или несколько Сrу-белков для защиты от чешуекрылых и жесткокрылых вредителей.

В мире известны тысячи штаммов Bt с разнообразными генами и широким потенциалом биологически активных белков, представляю­щих богатейший источник структурных компонентов многочисленных будущих препаратов для борьбы с самыми разнообразными вредителя­ми. Запатентовано более двухсот штаммов и генов.

Успехи генной инженерии неизмеримо расширили спектр биологи­ческих объектов, перспективных как доноры генов. Помимо растений ими могут быть насекомые, грибы, бактерии, вирусы. Отсюда стремле­ние биотехнологических компаний создавать свои частные банки генов. Так, фирма Бристайл-Майерс (США) имеет патенты на многие бакте­риальные культуры, в числе которых 28 образцов из Индии, а также из Бразилии, Перу, Филиппин, Фиджи и др. По нормам промышленного па­тентования фирма приобретает монопольное право на их использование.

В течение последних 10 лет использование маркерных последова­тельностей является основополагающим при идентификации ДНК и составлении геномных карт организмов. Обычно маркерные фрагменты ДНК соответствуют полиморфным сайтам или разным аллельным ва­риантам, которые в последующем можно идентифицировать, используя методы блот-гибридизации и полимеразной цепной реакции (PCR).

Регуляция активности генов, вставленных в ДНК генномодифици-рованного организма, осуществляется промотором и терминатором, которые могут быть объектами для амплификации и выявления соот­ветствующих генов в продуктах ГМР.

Промотор - «старт»-сигнал синтеза информационной РНК с гена, который указывает, где начинается ген; терминатор - «стоп»-сигнал, который прекращает синтез РНК и указывает, где заканчивается ген (рис. 49).

Рис.49. Генетическая конструкция генномодифицированного организма [32]

Амплификацию фрагмента ДНК между заданными праймерами ис­пользуют для наработки ДНК с уникальной области генома для после­дующего быстрого клонирования (рис. 50).

Рис. 50. Полимерная цепная реакция (PCR) идентификации генов [32].

С помощью метода PCR возможна также амплификация фрагмента ДНК, фланкирующего уже известную последовательность, что обуслов­ливает возможность идентификации генномодифицированных источни­ков пищи. Кроме того, в настоящее время с помощью PCR можно кло­нировать и изучать также РНК, составлять геномные карты, контроли­ровать наличие запатентованных генов и т. д.

При создании трансгенных растений не всегда применяют так на­зываемые «кассеты экспрессии», включающие в себя константные по­следовательности гетерологической ДНК: промотор 35S, терминатор NOS и селективный ген NPTII. Селективный ген необходим для отбо­ра трансгенных клеток. Для отслеживания процесса трансформации и селекции включают также маркерный ген. В качестве маркерных генов в основном используют GFP-ген, светящийся в ультрафиолете белок медузы или uidA (GUS) - бактериальный ген бетта-глюкуронидазы, дающий окраску ткани в синий цвет при наличии субстрата.

Однако в настоящее время появились трансгенные растения, кото­рые не содержат таких последовательностей ДНК. Иногда встраиваемый ген внедряется под промотор самого растения. Встраивание же маркерно­го гена не обязательно, так как его используют, как правило, для исследо­вательских проектов. Существуют также генетические технологии, по­зволяющие избавляться от селективного гена после одного скрещивания. Поэтому, в соответствии с Российским законодательством, заявитель продукции, полученной из ГМО, обязан предоставить экспертам данные о структуре рекомбинантной ДНК, внедренной в растительный геном.

В табл. 78 приведена краткая характеристика некоторых генов, применяемых для создания генномодифицированных организмов. Из этих данных видно, что используемые гены отличаются различным спектром действия, источником выделения и другими признаками.

Проблема генетических ресурсов Земли, то есть поиск природных источников генов, приобретает особую актуальность. Она, в свою оче­редь, обусловливает необходимость строгого контроля за распростране­нием трансгенных организмов.