73.1. Свойства цианокобаламина и его аналогов

Лекарственное вещество	Химическое название	Описание
Cyanocobalamin — цианокобаламин (Витамин B12)	Co-[(5,6-диметилбензимидазолил)]-Co-цианокобамид	Кристаллы или кристаллический порошок темно-красного цвета, без запаха. Гигроскопичен. Разлагается при температуре 200 C
Hydroxocobalamin — гидроксокобаламин (Оксикобаламин)	Co-[(5,6-диметилбензимидазолил)]-Co-гидроксокобамида гидрохлорид	Кристаллы или кристаллический порошок темно-красного цвета, без запаха. Гигроскопичен.
Cobamamide — кобамамид	Co[-(5,6-диметилбензимидазолил)]-Coаденозилкобамид	Темно-красный кристаллический порошок без запаха. Гигроскопичен.

Цианокобаламин и его аналоги сходны между собой по физическим свойствам. Они представляют кристаллические гигроскопичные вещества темно-красного цвета (табл. 73.1). Окраска обусловлена присутствием в молекулах атома кобальта (III). Цианокобаламин и кобамамид умеренно растворимы в воде (цианокобаламин медленно), гидроксокобаламин растворим в воде. В этаноле цианокобаламин умеренно растворим, гидроксокобаламин мало растворим, а кобамамид практически нерастворим. Гидроксокобаламин практически нерастворим в эфире, а цианокобаламин в эфире и хлороформе.

В основе испытаний кобаламинов лежат физико-химические свойства, обусловленные наличием в их молекулах атома кобальта.

Цианокобаламин можно обнаружить капельным методом. Если к водному раствору 0,5 мг цианокобаламина в пробирке прибавить 10 мг щавелевой кислоты и осторожно нагреть, то на фильтровальной бумаге, смоченной смесью раствора ацетата меди и бензидина, которой накрыта пробирка, появляется синее пятно.

Цианокобаламин и его аналоги можно идентифицировать по атому кобальта. Поскольку они представляют собой довольно прочные комплексные соединения, их необходимо предварительно подвергнуть минерализации. Ее можно осуществить в присутствии азотной кислоты. Полученный при этом нитрат кобальта образует окрашенный продукт с азокрасителем пиридоксина в водно-ацетоновой среде при рH 7 с максимумом поглощения при 515–520 нм.

Обнаружить кобальт (по ФС) можно также после сплавления цианокобаламина или гидроксокобаламина с гидросульфатом калия. Затем открывают ион кобальта после нейтрализации раствором гидроксида натрия (по фенолфталеину), прибавления ацетата натрия и уксусной кислоты. Реакция основана на образовании имеющего красный цвет внутрикомплексного соединения кобальта с нитрозо-R-солью (динатриевой солью 1-нитрозо-2-нафтол-3,6-дисульфокислоты):

Окраска сохраняется после добавления хлороводородной кислоты и кипячения в течение 1 мин.

Ион кобальта можно также обнаружить после выпаривания и прокаливания 0,25 мг цианокобаламина с 10 мг сульфата калия и 2 каплями 15%-ной серной кислоты. К остатку прибавляют насыщенный раствор роданида аммония в ацетоне; появляется сине-зеленое окрашивание:

Co²⁺ + 2NH₄NCS  Co(NCS)₂ + 2NH₄⁺

Для испытания подлинности и чистоты, а также количественного определения цианокобаламина и его аналогов используют УФ-спектрофотометрию.

При испытании подлинности устанавливают наличие максимумов поглощения 0,002%-ного водного раствора цианокобаламина при 278, 361 и 550 нм. Устанавливают также отношение величин оптической плотности при 361 нм и 278 нм (1,7–1,88), а также при 361 нм и 550 нм (3,15–3,40). Указанные параметры делают более надежной идентификацию цианокобаламина в УФ-области. Они также используются при испытании цианокобаламина на чистоту.

Для этой же цели, при испытании на посторонние примеси (допускается не более 4%) применяется метод ТСХ. Его выполняют на пластинках Силуфол УФ-254. Хроматографируют восходящим методом различные количества цианокобаламина (50; 0,5; 1,0; 1,5 мкг) в системе растворителей: хлороформ-метанол-10%-ный раствор аммиака (15:10:3). Сравнивая величину пятен и интенсивность их красной окраски, делают заключение о наличии посторонних примесей.

Растворы кобамамида в 0,03 М растворе ацетата натрия имеют максимумы поглощения при 260 и 375 нм, а также максимум в видимой области спектра при 522 нм. Если 0,002%-ный раствор кобамамида облучить светом от лампы накаливания (100 Вт) в течение 30 мин, то по окончании фотолиза раствор приобретает характерный максимум поглощения при 351 нм. Для установления наличия поглощающих примесей измеряют оптическую плотность 0,002%-ного раствора в том же растворителе в максимумах при длинах волн 260, 280, 375 и 522 нм. Величины отношений оптических плотностей должны быть при длине волны 280 нм к 260 нм от 0,6 до 0,65; при 375 нм к 260 нм от 0,28 до 0,33; при 522 нм к 260 нм от 0,21 до 0,26.

Растворенный в ацетатном буфере (рH 4,5) гидроксокобаламин имеет в области 250-550 нм три максимума поглощения при 274, 351 и 525 нм. Отношение поглощения при 525 нм к таковому при 351 нм от 0,3 до 0,35, а при 274 нм к 351 нм от 0,75 до 0,85. Для отличия от цианокобаламина используют специфичную на гидроксокобаламин реакцию с раствором карбоната лития в пикриновой кислоте. Выполняют также реакцию на хлориды.

При испытании гидроксокобаламина на чистоту устанавливают предельное содержание неидентифицированных окрашенных примесей (не более 3%), используя для этой цели пластинки Силуфол УФ-254. Определяют также содержание цианокобаламина и других кобаламинов (не более 3%) и наличие других примесей (не более 3%). Методом ГЖХ определяют содержание остаточного растворителя — ацетона (не более 0,4%).

Количественно определяют цианокобаламин в водных растворах при длине волны 361 нм, параллельно измеряя оптическую плотность ГСО цианокобаламина в тех же условиях. Расчет содержания цианокобаламина (не менее 95%) выполняют по оптической плотности ГСО. Количественное определение гидроксокобаламина выполняют спектрофотометрическим методом в ацетатном буфере при длине волны 351 нм. Содержание рассчитывают по предварительно установленному удельному показателю поглощения безводного гидроксокобаламина. Аналогичный способ лежит в основе спектрофотометрического количественного определения кобамамида (ФС). Растворителем служит буферный раствор (рH 2). Оптическую плотность измеряют на спектрофотометре при длине волны 459 нм. Содержание кобамамида вычисляют по удельному показателю поглощения (55).

Известен микробиологический метод определения цианокобаламина с помощью культуры E.coli, основанный на определении зон стимуляции тест-микроорганизма. Однако этот метод длителен, требует чистой культуры, сложных питательных сред, асептических условий. Учитывая, что около 4,5% молекулярной массы цианокобаламина составляет элемент кобальт, для определения может быть использован также атомно-абсорбционный метод.

Цианокобаламин хранят, учитывая гигроскопичность, в хорошо укупоренной таре, соблюдая асептические условия, ибо микрофлора поглощает витамин B₁₂. Он разрушается от действия окислителей и восстановителей. Необходимо также предохранять от действия света. Водные растворы цианокобаламина устойчивы при рH 4,0–6,0. Гидроксокобаламин хранят в плотно укупоренной таре, предохраняющей от действия света, в сухом прохладном месте (при температуре не выше +10C). Он очень гигроскопичен и даже в темноте постепенно разлагается во влажной атмосфере, особенно при повышенной температуре. Кобамамид хранят в сухом, защищенном от света месте, при температуре не выше +5C.

Кобамамид предотвращает дегенеративные изменения нервной ткани и проявляет антианемическое действие. Цианокобаламин назначают для лечения злокачественного малокровия, различных видов анемии, при лучевой болезни, заболеваниях печени, нервной системы, кожных и других заболеваниях. Вводят цианокобаламин внутримышечно, подкожно, внутривенно по 100–200 мкг, реже до 500 мкг. Показания для применения гидроксокобаламина те же, что и у цианокобаламина, выпускают его в ампулах по 1 мл 0,01, 0,05 и 0,1%-ные растворов (соответственно 100, 500 и 1000 мкг в 1 мл). Кобамамид проявляет также анаболическое действие. Его применяют при B₁₂-дефицитных анемиях, в комплексной терапии при лечении заболеваний печени и периферической нервной системы. Назначают внутрь, внутривенно и внутримышечно (по 0,0005–0,001 г в сутки).