Мембранные рецепторы

В отличие от рецепторов, взаимодействующих с липофильными гормонами, которые легко проникают через мембрану клетки-мишени, рецепторы для липофобных гормонов (белково-пептидных) располагаются на поверхности клеточной мембраны, поскольку эти гормоны не могут попасть в клетку. И, поскольку формирование комплекса гормон — рецептор происходит на внешней поверхности клетки, ответные внутриклеточные события реализуются посредством использования механизма передачи сигнала, обеспечивающего быструю реакцию. Быстрота ответа обеспечивается тем, что мембранный рецептор находится в связанном со вторичным мессенджером состоянии (в роли первичного мессенджера выступает гормон), т. е. система передачи сигнала находится в постоянной готовности, ее необходимо только активировать образованием комплекса гормон — рецептор. Такое взаимодействие обеспечивает быструю активацию клеточного ответа и столь же быстрое его выключение.

Передача внешнего сигнала, который поступает вместе с молекулой гормона, к внутриклеточной цепи передачи сигнала обеспечивается благодаря особому химическому строению мембранных рецепторов. Все они состоят из трех различных частей, несмотря на то, что сам по себе рецептор обычно представлен одной полипептидной цепью (Spiegel et al., 2003). Внеклеточный компонент располагается па N-терминальном конце аминокислотной последовательности и содержит гликозилированные участки. Углеводные остатки, расположенные в этих участках, могут принимать участие в связывании с гормоном, которое специфически происходит в цистеинбогатых карманах. Каждый из трансмсмбранных компонентов рецептора, а мембранные рецепторы обычно имеют несколько трансмембранных участков, состоит примерно из 25 липофильных аминокислот и формирует спиральную структуру. Внутриклеточный компонент располагается на С-концевом участке полипептидной цепи и отвечает за эффекторную функцию рецептора. Как правило, внутриклеточный регион, состоящий из липофобных аминокислот, содержит регуляторные участки, в частности участки фосфорилирования.

Хотя действие мембранных рецепторов опосредовано передачей сигнала по многочисленным путям вторичных мессенджеров, на основании особенностей пострецепторных взаимодействий их можно разделить на следующие классы:

• лиганд-чувствительные каналы;

• рецепторассоциированные киназы;

• рецепторассоциированная гуанилатциклаза;

• цитокиновые рецепторы;

• G-белок сопряженные рецепторы.

В первых трех классах при связывании гормона рецептор сам непосредственно стимулирует клеточную реакцию, но в случае цитокиновых и G-белок сопряженных рецепторов рецептор для стимуляции специфического клеточного ответа, вызванного гормоном, использует активацию еще одной молекулы — промежуточного мессенджера.

В случае гормончувствительных каналов белок-рецептор формирует не только внеклеточный гормоносвязывающий компонент, но и капал через клеточную мембрану, который при открывании делает возможным транспорт определенных ионов. Открывание канала происходит при связывании лиганда, которое приводит к конформационному сдвигу трансмембранных спиралей и формированию прохода через мембрану для определенных ионов. Такой тип рецепторов встречается на возбудимых клетках, в частности на нейронах и миоцитах, где перенос ионов через мембрану приводит к изменению мембранного потенциала и последующей стимуляции ответа клетки-мишени.

Наиболее изученным и распространенным рецептором, обладающим киназной активностью, является тирозинкиназа. В геноме человека было идентифицировано примерно 100 тирозинкиназных рецепторов (Spiegel et al., 2003). Хотя все они имеют общие особенности организации трансмембранного компонента, внеклеточный компонент характеризуется высокой степенью вариабельности, обеспечивающей возможность специфического взаимодействия с различными лигандами. В отличие от большинства мембранных рецепторов члены семейства тирозинкиназных рецепторов взаимодействуют только один раз. В то же время подобно многим другим рецепторам при связывании с гормоном они димеризуются и это событие является ключевым моментом в активации рецептора. После такой активации специфический участок внутриклеточного компонента рецептора фосфорилирует тирозиновые остатки фермента внутри клетки и таким образом стимулирует необходимые клеточные процессы. Более того, активированный рецептор способен фосфорилировать свои собственные тирозиновые остатки, расположенные в цитоплазме. Такое “аутофосфорилирование" позволяет рецептору сохранить активное состояние и усилить сигнал, переданный гормоном. Прекращение гормониндуцированного клеточного ответа происходит после диссоциации комплекса гормон—рецептор и дефосфорилирования рецептора клеточными фосфатазами.

Другие рецепторассоциированные киназы, представленные меньшим количеством но сравнению с тирозинкиназными рецепторами, имеют сходный механизм передачи сигнала и стимуляции клеточного ответа путем фосфорилирования определенных ферментов в цитоплазме клетки-мишени. Рецепторы, обладающие протеинкиназной активностью, могут осуществлять фосфорилирование остатков треонина и серина ферментов внутри клетки. И точно так же стимуляция клеточного ответа прекращается после диссоциации комплекса гормон — рецептор и дефосфорилирования активного фермента клеточными фосфатазами. Такое сходство поведения демонстрирует общие принципы реализации механизма функционирования мембранных рецепторов: гормон — индуцированная реакция клетки “выключается” как на внеклеточном, так и на внутриклеточном уровне.

Рецепторы, использующие для передачи сигнала гуанилатциклазу, представляют собой еще одно семейство мембранных рецепторов, которые имеют в своем составе каталитический компонент и способны самостоятельно стимулировать клеточную реакцию. По сравнению с другими типами мембранных рецепторов это семейство менее многочисленно, похоже, что только найтрийуретический фактор, продуцируемый клетками сердечной мышцы, использует рецепторы этого типа для осуществления регуляции активности своих клеток-мишеней. В этом случае передача сигнала первичного мессенджера (гормона) внутрь клетки осуществляется с помощью одного мембранного рецептора. После связывания лиганда с внеклеточным компонентом в молекуле рецептора происходят конформационные изменения, которые приводят к активации гуанилатциклазы — фермента, который является частью внутриклеточного компонента рецептора. Активированный фермент превращает гуанозинтрифосфат (ГТФ) в циклический гуанозинмонофосфат (цГМФ), который в свою очередь активирует нуклсотидзависимыс протеинкиназы клетки, которые осуществляют фосфорилирование других цитоплазматических белков.

Цитокиновые рецепторы но механизму действия очень похожи на тирозин киназные: они также используют тирозинкиназы для индукции клеточного ответа. Основным отличием является то, что у цитокиновых рецепторов внутриклеточный компонент не обладает тирозинкиназной активностью. Тирозин-киназа в данном случае представляет собой независимый белок. Представители семейства цитокиновых рецепторов, которое включает рецепторы гормона роста и пролактина, состоят из нескольких субъединиц. После связывания с лигандом эти рецепторы формируют олигомеры и активируют янус тирозинкиназы (janus trosine kinase, JAK), которые располагаются поблизости от рецепторов на внутренней стороне плазматической мембраны клетки (Heim, 1999). Сами по себе цитокиновые рецепторы не проявляют никакой ферментативной активности (Argetsingcr et al., 1993). Создается впечатление, что активация JAK происходит в результате их “стягивания” в одно место с рецепторами после формирования олигомеров комплексов гормон — рецептор и последующего взаимного трансфосфорилирования тирозиновых остатков. После этого активированные киназы осуществляют фосфорилирование ферментов в цитозоле, что в результате приводит к передаче сигнала, поступившего к клетке с гормоном. Как в описанной выше ситуации, прекращение гормониидуцированной клеточной реакции происходит после диссоциации комплекса гормон — рецептор, а также инактивации тирозинкиназ путем их дефосфорилирования клеточными фосфатазами.

Наиболее многочисленной группой мембранных рецепторов является семейство G-белок сопряженных рецепторов. Более тысячи различных лигандов используют эти рецепторы для передачи сигнала (Spiegel et al., 2003). Однако во всех случаях G-белок и ассоциированный с ним рецептор представляют собой два различных белка, которые связаны между собой только функционально, но не структурно. Несмотря на то что рецепторы этого семейства имеют 7 трансмембранных участков, они неспособны самостоятельно регулировать внутриклеточные процессы после связывания с гормоном. Для этого они используют расположенные по соседству на внутренней поверхности мембраны G-белки, которые после образования комплекса гормон — рецептор индуцируют клеточный ответ. G-белки, которые получили свое название из-за потребности в ГТФ для осуществления своих функций, могут оказывать стимулирующее (Gs) или ингибирующее (Gi) действие, при этом более распространенной является первая ситуация.

Все G-белки представляют собой гетеротримеры, т. е. состоят из трех субъединиц, которые называются а, р, у. В неактивном состоянии а-субъединица связана с гуанозиндифосфатом, однако после связывания гормона с рецептором происходит замена ГДФ на ГТФ и активация G-белка. Активный G-белок может стимулировать разнообразные внутриклеточные системы вторичных мессенджеров и, таким образом, регулировать — причем даже одновременно — несколько внутриклеточных процессов. Рассмотрим в отдельности основные системы передачи сигнала, используемые активным G-белком.

Циклический аденозинмонофосфат (цАМФ).

В этой системе вторичной передачи сигнала активный G-белок стимулирует фермент аденилатциклазу, расположенную на внутренней стороне плазматической мембраны клетки и катализирующую реакцию превращения АТФ в цАМФ. Эта реакция обладает некоторым сходством с реакцией превращения ГТФ в цАМФ, осуществляемой гаунилатциклазными рецепторами после стимуляции путем образования комплекса гормон — рецептор. Однако помимо используемого субстрата эти ферментативные системы различаются еще и тем, что аденилатциклаза не является компонентом рецепторного комплекса.

Образовавшиеся молекулы цАМФ способны инициировать разнообразные внутриклеточные процессы главным образом за счет активации разнообразных цАМФ-зависимых протеинкиназ, которые также называют РКА. Как и все другие представители семейства киназ, РКА стимулируют клеточный ответ путем осуществления фосфорилирования ферментов специфических биохимических путей. Поскольку в клетках-мишенях каждого типа экспрессируется собственный набор РКА и кииазактивируе-мых путей, одна система передачи информации может быть использована для контроля специфических биохимических процессов. И в соответствии с механизмами действия гормонов в целом на каждом этапе передачи сигнала, поступившего с гормоном, происходит его усиление.

Продукция цАМФ образуется в пределах секундных интервалов времени и благодаря этому клеточный ответ развивается очень быстро, но если при этом не происходит постоянного обновления комплексов гормон — рецептор этот ответ столь же быстро прекратится. В остановке ответной реакции, индуцированной цАМФ, принимают участие два фермента: фосфодиэстераза расщепляет связи цАМФ и инактивирует это соединение, а фосфатазы дефосфорилируют ферменты, стимулированные РКА. В результате реакции, индуцированные цАМФ, достаточно быстрые и скоротечные.

Вместе с тем не все биологические процессы, ассоциированные с цАМФ, имеют небольшую продолжительность. Известно, что цАМФ может регулировать транскрипцию некоторых белков, имитируя воздействие стероидных и тиреоидных гормонов, и таким образом вносить долговременные изменения в жизнедеятельность клетки.

Гены, регулируемые цАМФ, содержат так называемые цАМФ-чувствительные элементы (сАМР response elements) последовательности, которые при стимуляции действуют в качестве энхансеров транскрипции. Их стимуляция происходит при участии специфической цАМФ-зависимой протеинкиназы, которая фосфорилирует белок, связывающий цАМФ-чувствителъные элементы (cAMP responsive elements binding protein, CREB). После активации CREB выступает в роли транскрипционного фактора и связывается с цАМФ-чувствительпыми элементами ДНК. Гены, транскрибируемые при участии CREB, могут различаться в зависимости от типа клеток. В данном случае мы снова имеем иллюстрацию того, как различные клетки-мишени реагируют на один и тот же механизм передачи сигнала специфическим образом, который предопределен существующими в клетке биохимическими системами.

Фосфатидилинозитольная система.

Это еще одна система вторичных мессенджеров, используемая G-белокассоциированными мембранными рецепторами, которая применяет для передачи сигнала продукты реакции расщепления одного из фосфолипидных компонентов клеточной мембраны — фосфатидилинозитола. Эту реакцию катализирует фосфолипаза С — фермент, который связан с мембраной и активируется под влиянием G-белка. После связывания гормона с рецептором фосфолипаза С расщепляет фосфатидилинозитол на диацилглицерин (ДАГ) и инозитолтрифосфат, каждое из этих веществ индуцирует клеточный ответ. Инозитолтрифосфат переходит в цитоплазму клетки и, взаимодействуя с эндоплазматическим ретикулумом, стимулирует выброс кальция в цитоплазму. Увеличение концентрации кальция в цитоплазме является одним из основных способов стимуляции различных клеточных процессов посредством активации кальцийзависимых ферментов.

В отличие от инозитолтрифосфата диацилглицерин остается в связанном состоянии на внутренней стороне клеточной мембраны, где он активирует мембранную протеинкиназу С (РКС). Активация протеинкипазы С происходит только под воздействием ДАГ в присутствии повышенных концентраций кальция в цитоплазме, т. е. действие инозитолтрифосфата и ДАГ являются синергичными. Как и другие киназы, РКС осуществляет активацию ферментов клетки путем их фосфорилирования.

Процессы, стимулированные фосфатидилинозитольной системой передачи сигнала, затухают после дефосфорилирования инозитолтрифосфата и превращения его в ииозитол, а также инактивации ДАГ путем фосфорилирования этого соединения. Снижение концентрации ионов кальция в цитоплазме к исходному уровню приводит к подавлению активности внутриклеточных ферментов, стимулированных РКС.

Помимо непосредственно сопряженных с рецептором ионных каналов, которые открываются при образовании комплекса гормон — фермент, существуют также ионные каналы, состояние которых регулируется гормончувствительным рецептором при посредничестве G-белка. В этом случае мембранный рецептор и трансмембранный ионный канал представляют собой независимые белки. При формировании комплекса лиганд — рецептор G-белок, расположенный в мембране рядом с рецептором, взаимодействует с белком, образующим канал. Это взаимодействие приводит к конформационным изменениям белка капала, открыванию канала и перемещению ионов через мембрану. Обычно при открывании канала в клетку попадает большое количество ионов и соответственно происходит увеличение их концентрации в цитоплазме (Finn et al., 1996). Возможно, наилучшим примером реализации этого механизма передачи сигнала является гладкомышечная клетка, где G-белки регулируют открывание специфических ионных каналов в плазмалемме, что приводит к резкому увеличению концентрации кальция в цитозоле. В покое концентрация кальция в цитозоле этих клеток составляет 0,1 —0,2 мкмоль-л"1, однако при гормон-индуцированной активации кальциевых каналов концентрация этих ионов быстро повышается до 1 ммоль-л'1. Такое увеличение концентрации ионов кальция намного превышает наблюдаемое в случае открывания каналов, входящих в состав рецептора.

В некоторых случаях повышение концентрации ионов кальция оказывает воздействие на внутриклеточные процессы опосредованно. Существенное увеличение содержания ионов кальция в цитоплазме увеличивает вероятность их взаимодействия со специфическими кальцийсвязывающими белками внутри клетки. Наиболее изученным среди таких белков является кальмодулин, который можно обнаружить практически в любой клетке. Этот белок имеет четыре сайта связывания и обладает высоким сродством к кальцию. После того как кальций, источником которого могут служить и внутренние депо, свяжется со всеми четырьмя сайтами, комплекс кальций — кальмодулин приобретает способность активировать ферменты, чаще всего киназы. Киназы в свою очередь активируют ферменты, которые принимают непосредственное участие в клеточных процессах, индуцированных действием гормона, связавшегося с внешней поверхностью мишени. Клеточный ответ затухает после диссоциации комплекса гормон — рецептор и последующего закрывания каналов. После этого аденозиитрифосфатзависимые кальциевые насосы возвращают ионы кальция в место первоначальной локализации, т. с. в эндоплазмтический ретикулум или за пределы клетки.