Биологическое действие различных изоформ соматотропного гормона

Показано, что изоформа СТГ с молекулярной массой 22 кДа ответственна за широкий спектр биологических воздействий. Предполагается, что часто противоположные по характеру воздействия соматотропного гормона, возможно, объясняются тем, что их осуществляют различные изоформы СТГ. Получение очищенных препаратов СТГ с молекулярной массой 5, 17 и 20 кДа сделало возможным определение их биологических эффектов. Установлено, что СТГ с молекулярной массой 5 кДа усиливает действие инсулина и устраняет резистентность к нему у желтых мышей с ожирением, а 17 кДа форма гормона в случае инъекций собакам оказывает сильное диабетогенное воздействие. Соматотропный гормон с молекулярной массой 20 кДа связывается с рецептором СТГ (Wada et al., 1997, 1998) и при инъекции снижает уровень с молекулярной массой варианта СТГ 22 кДа и повышает уровень свободных жирных кислот и ИФР-1 в сыворотке крови у человека (Hashimoto et al., 2000). Эти результаты свидетельствуют о липолитическом и ростостимулирующем действии соматотропного гормона. Авторы этого исследования считают, что их данные показывают, что “регуляция секреции 20 кДа изоформы СТГ с физиологической точки зрения не отличается от таковой 22 кДа СТГ и изоформа гормона с молекулярной массой 20 кДа регулирует уровень СТГ посредством цепи отрицательной обратной связи” (Hashimoto et al., 2000, р.601).

История участия в проекте стг-2000 (gh-2000)

В 1993 г. Питер Сонксеи как член Медицинского подкомитета Международного олимпийского комитета (МОК) предложил написать обзор, посвященный СТГ и регулярной двигательной активности (Cuneo, Wallace, 1994). Впоследствии МОК и Европейский союз финансировали исследования, направленные на разработку стратегии обнаружения использования СТГ в качестве допинга, в которых примяли участие члены группы СТГ-2000, центры которой располагались главным образом в Госпитале Св.Томаса в Лондоне (проф. Питер Сонксеи), Госпитале Орхуса в Дании (проф. Йенс С. Кристиансен), Госпитале Сальгренска, Швеция (нроф. Бент-Аке Бентсон) и Госпитале Неаполя, Италия (проф. Луиджи Сакка). В составе этой группы работали также ученые из Германии, Швейцарии и Австралии.

'ПОИСК АДЕКВАТНЫХ МАРКЕРОВ ПРИМЕНЕНИЯ СТГ - “WASHOUT STUDY”

Нашим основным вкладом в реализацию этой программы стало исследование, получившее название .“Washout Study” и направленное на определение: а) наиболее показательных маркеров применения рСТГ; б) срочных изменений этих маркеров под влиянием интенсивной физической нагрузки (самой по себе и в сочетании с применением рСТГ); в) кинетики исчезновения этих маркеров после прекращения приема СТГ. Семнадцать мужчин в возрасте 18— 40 лет с индексом массы тела (ИМТ) 23,6±0,6; с высоким уровнем привычной аэробной двигательной активности и аэробной физической подготовленности (V02max 56,0 ± 1,2 мл-кг_|-минн) принимали участие в эксперименте семь раз. После первичного осмотра (посещение 1) их разделили случайным образом для проведения исследований в состоянии покоя или при воздействии физической нагрузки в перекрестном эксперименте, где результаты исследования в состоянии покоя являлись контролем для исключения эффектов положения тела. После этого был произведен повторный случайный выбор участников для двойного слепого исследования эффектов применения рСТГ в количестве 0,15 МЕ-кг'^день'1 в течение 7 дней с использованием идентичного плацебо в качестве контроля. Препарат вводили самостоятельно подкожной инъекцией в область живота ежедневно в 20:00, прием 7-й дозы осуществлялся за 3 ч до посещения после применения соматотропина (посещение 4). Занятие физическими упражнениями было повторено во время посещения 4, а также после прекращения применения СТГ во время посещений 5, 6 и 7, которые происходили через 24, 48 и 96 ч после посещения 4. Для проведения всех тестов с субмаксимальной физической нагрузкой использовали идентичный протокол, включавший три последовательных этапа: 1—5 мин с нагрузкой 1 Вт.-кг'1; 2—5 мин с нагрузкой 2 Вкг~'; 3—20 мин с нагрузкой 65 % от нагрузки, преодолеваемой при определенном заранее V02max (соответствует примерно 80 % V02max).

Интенсивные физические упражнения вызывают кратковременное эквимолярное повышение примерно на 20 % уровня общего ИФР-I, IGFBP-3 и кислотно-лабильного компонента (ALS) в сыворотке крови, что существенно выше эффекта гемоконцентрации (см. Mottram, 1999).

Проведенные исследования позволили нам предположить существование нового механизма регуляции тройного комплекса ИФР. Эти результаты подтверждают данные Байга с соавторами (Bang et al., 1990), которые показали увеличение содержания ИФР-I в сыворотке крови на 26 %. Недостатками этого исследования было очень небольшое количество участников экспериментов (3 мужчины и 3 женщины), отсутствие перерывов для отдыха и непрерывная нагрузка, равная 60 % V02max, на велоэргометре в течение 30 мин. Исследования, проведенные после наших экспериментов с использованием сопоставимой интенсивности физических упражнений, также подтвердили изменения уровня ИФР-I после интенсивной физической нагрузки. Десять минут велоэргометрии при нагрузке 72 % V02max приводили к увеличению на 14 % уровня ИФР-I в сыворотке крови у 11 лиц первого зрелого возраста (10 мужчин и 1 женщина), который достигал максимального значения в конце занятия физической активностью, которое достоверно отличалось от исходного базового уровня, измерявшегося через 20 мин после завершения занятия (Cappon et al., 1994). Вместе с тем при проведении этого исследования не был предусмотрен контроль в состоянии покоя. Аналогичные результаты с применением идентичной программы физических упражнений были получены еще в одной работе (Schwartz et al., 1996): у 10 физически активных юношей в конце занятия двигательной активностью наблюдали повышение уровня ИФР-I в сыворотке крови на 13,3 %; через 10 мин отдыха этот показатель возвращался к исходному уровню. В статье также показано, что изменения ИФР-I под влиянием физической нагрузки зависят от интенсивности упражнений и не связаны с изменениями уровня СТГ, поскольку упражнения с нагрузкой, составляющей 46 % V02max, не влияли на уровень СТГ, но все еще вызывали повышение среднего уровня ИФР-I на 7,7%.

Уникальным аспектом нашего исследования было определение концентрации свободного ИФР-I в ответ на интенсивную физическую нагрузку у спортcменов, которую обычно из-за значительной трудоемкости и стоимости проводили только в начале и в конце занятия. Интенсивная двигательная активность не вызывала изменений уровня свободного ИФР-1 в крови, а это свидетельствует о том, что увеличение общего содержания ИФР-1 в сыворотке крови происходит за счет возрастания его количества в составе комплекса с ИФР-связывающими белками и ALS. Подробное обсуждение свойств тройного комплекса ИФР / IGFBP-3 / ALS представлено ниже.

Резкое сильное повышение уровня свободного ИФР-1 во время выполнения физических упражнений было бы неэффективным, поскольку этот фактор обладает мощным инсулиноподобным действием и поэтому может отрицательно влиять на доставку к работающим тканям глюкозы и жиров. Если во время интенсивного занятия двигательной активностью возникает потребность в дополнительных количествах ИФР-1, более обоснованной с точки зрения физиологии была бы его доставка в связанной форме, обеспечивающей при необходимости возможность быстрого высвобождения.

Увеличение концентрации связанного ИФР-1 во время интенсивной двигательной активности может иметь ряд функций. Вполне возможно, что метаболическую активность во время интенсивной физической нагрузки проявляет свободный ИФР-1. Отсутствие изменений его в концентрации во время выполнения физических упражнений может маскировать возрастание скорости выведения или превращения свободного ИФР-1. Если это действительно имеет место, можно предположить, что увеличение пула связанного ИФР-1 во время интенсивной двигательной активности может играть роль резервного запаса, обеспечивающего возможность быстрого восстановления концентрации свободного фактора в случае необходимости. Показано, что ИФР-1 остается стабильным в течение дня, поэтому его уровень должен регулироваться достаточно жестко. Появление дополнительного резерва в условиях метаболического стресса позволяет обеспечивать равновесие между концентрациями свободного и связанного ИФР-1 в случае краткосрочного резкого возрастания потребности в нем. Возможно, что физическая нагрузка является сигналом для выделения ИФР-1 в виде комплексов со связывающими белками, которые затем могут быть сразу направлены к тканям-мишеням, и повышение уровня связанного фактора в крови просто отражает остаточные явления после его срочного выброса. Возможно также, что дополнительное количество ИФР-1, появляющееся в крови при воздействии физической нагрузки, вовлекается в обмен только после окончания физической нагрузки. ИФР может оставаться в связанной форме, циркулируя в крови в виде комплекса со своими связывающими белками, распределяться по тканям-мишеням или высвобождаться в кровь в свободном виде. Мы не проводили оценки свободного СТГ после интенсивной двигательной активности и поэтому не можем сделать каких-либо заключений в отношении взаимопревращений связанной и свободной формы ИФР-1.

Происхождение ИФР-1, выделяющегося в кровь под влиянием физической нагрузки, неизвестно. Считается, что ИФР-1, циркулирующий в крови, имеет преимущественно печеночное происхождение и вырабатывается под влиянием СТГ. Вместе с тем свой вклад в увеличение его концентрации может вносить и утечка или активная секреция в других тканях тела. Для стимуляции продукции ИФР-1 в печени под влиянием СТГ требуется достаточно много времени, поэтому, если печень является местом секреции, обеспечивающим быстрое нарастание концентрации ИФР-1 в сыворотке крови, то эта секреция, вероятнее всего, не зависит от стимуляции СТГ. Электростимуляция нервных окончаний изолированной конечности кошки с искусственной перфузией приводит к повышению уровня ИФР-1 в перфузируемой жидкости, что подтверждает возможность секреции этого фактора в других тканях организма помимо печени при воздействии физической нагрузки (Sara et al., 1982). В другой работе показано, что ткани конечности человека при выполнении физической работы могут вырабатывать ИФР-1 (Brahm et al., 1997b). Таким образом, локальные эффекты, им опосредуемые, вполне могут быть результатом таких индуцированных физическими упражнениями изменений ИФР.

Биологическое значение повышения концентрации ИФР-1 в ответ на интенсивную физическую нагрузку в настоящее время неизвестно. Если проанализировать распределение рецепторов ИФР-1 в различных тканях, а также результаты исследований быстрой реакции организма человека на введение рекомбинантного ИФР-1 человека, можно будет очертить круг возможных метаболических эффектов, происходящих при участии индуцированного физической нагрузкой ИФР-1. Два главных хранилища энергетических субстратов организма, а именно печень и жировая клетчатка, не имеют функциональных рецепторов к ИФР-1 и, вероятно, не могут быть основными мишенями ИФР-1, индуцированного физической нагрузкой. Вместе с тем его рецепторы в большом количестве обнаруживаются в поджелудочной железе и скелетных мышцах, которые поэтому логично рассматривать как мишени точных изменений уровня ИФР-1. Для срочной реакции организма на физическую нагрузку характерно существенное снижение уровня инсулина в крови. Возможно, резкое повышение ИФР-1 и его последующее действие через рецепторы поджелудочной железы может быть причиной падения концентрации инсулина во время регулярной двигательной активности. В случае обработки ИФР-1 перфузируемой поджелудочной железы наблюдается подавление секреции инсулина (Leahy, Vande-kerkhove, 1990), а при введении ИФР-1 человеку снижение концентрации инсулина в крови может происходить даже в условиях эугликемического блока (Boulware et al., 1992). Поэтому возможно, что небольшое резкое повышение уровня ИФР-1 под влиянием физической нагрузки может способствовать снабжению тканей организма энергетическими субстратами в виде глюкозы и жиров благодаря устранению воздействия на гепатоциты и адипоциты инсулина, который стимулирует запасание, а не высвобождение энергетических субстратов этими клетками. Выброс IGFBP-3 и ALS вместе с ИФР-1 в условиях физической нагрузки, вероятно, позволяет избежать значительного повышения уровня свободного ИФР-1, который при избыточной концентрации мог бы взаимодействовать с рецепторами инсулина гепатоцитов и адипоцитов и влиять на поглощение и выделение энергетических субстратов, необходимых для выполнения физической работы. Предполагается также, что ИФР-1 благодаря способности подавлять протеолиз обладает действием, сохраняющим белок. Внезапное повышение ИФР-1 в ответ на физическую нагрузку может таким образом выполнять функцию подавления потенциальных катаболических реакций с участием белка. В ряде исследований показано, что применение ИФР-1 приводит к уменьшению деградации белка. Например, в случае применения ИФР-I у мужчин наблюдается снижение окисления лейцина (Nussey et al., 1994), кроме того, у женщин и мужчин происходит заметное снижение появления аминокислот с разветвленными цепями (Boulware et al., 1992).

Внезапное повышение уровня ИФР-I в ответ на физическую нагрузку может оказывать влияние на транспорт глюкозы в работающие мышцы. Во время резкого увеличения физической нагрузки возрастает утилизация глюкозы в периферических тканях. Увеличение потребления глюкозы мышечной тканью во время физической нагрузки может происходить благодаря увеличению кровоснабжения мышц под влиянием ИФР-I. Выраженное сосудорасширяющее действие ИФР-I было продемонстрировано после введения его в плечевую артерию 9 мужчинам — уже через 5 мим после инъекции сильно увеличилось кровообращение в предплечье. В основе этого эффекта лежит синтез оксида азота, индуцированный ИФР-1, поскольку блокада синтеза оксида азота монометил-L-аргинином устраняет эффект усиления кровообращения под влиянием ИФР-I (Kiowsky et al., 1994). Эти результаты были подтверждены в другом, более обширном исследовании (Fryburg, 1996). Установлено, что введение СТГ в плечевую артерию стимулирует резкое эндотелийзависимос расширение сосудов и соответствующий путь передачи сигнала с участием оксида азота (Napoli et al., 2003). Эти же авторы показали отсутствие изменений уровня ИФР-I в предплечье во время вве- Я дения СТГ и сделали вывод о том, что сосудорасширяющий эффект СТГ не связан с ИФР-I, циркулирующим в крови.

Установлено, что подкожная инъекция ИФР-I у человека влияет на проницаемость кровеносных капилляров кожи и сетчатой оболочки глаза (Franzeck et al., 1995а, 1995b). Вполне возможно, что подобные изменения после регулярной двигательной активности могут затрагивать не только сосуды кожи и глаза, но и другие участки сосудистой системы, и представлять собой потенциальный механизм обеспечения транспорта бинарных комплексов ИФР-I к тканям-мишеням.

В период после интенсивной двигательной активности наблюдается значительное до 50 % повышение уровня IGFBP-1, которое может быть направлено на снижение до минимума гипогликемии, возникающей после интенсивной физической нагрузки. Быстрый ответ организма на занятия физическими упражнениями не затрагивает IGFBP-2 и свободного ИФР-I. Применение рекомбинантного рСТГ вызывает у человека сильное повышение свободного и общего ИФР-I, IGFBP-3 и ALS, а также небольшое снижение уровня IGFBP-1 и IGFBP-2, в то же время все эти индуцированные рСТГ изменения восстанавливались к исходному уровню в течение 4 дней. Происходящие под влиянием интенсивных упражнений изменения общего содержания рСТГ в сыворотке крови у большинства людей восстанавливались через несколько дней после применения рСТГ, предположительно в результате активации ИФР-опосредованной цепи отрицательной обратной связи. Таким образом, ИФР-I, а возможно, и некоторые ИФР-связывающие белки (IGFBP), учитывая их стабильность в течение суток и слабую реакцию на физическую нагрузку, могут быть подходящими маркерами употребления СТГ как допинга.

Система СТГ-ИФР, относительные изменения компонентов. Данные оценок отдельных показателей были выражены в виде баллов стандартного отклонения (Z-оценка) с использованием средних значений и стандартных отклонений в состоянии покоя до начала применения СТГ в качестве данных для сравнения. В группе, где применяли рСТГ, после 7 дней приема гормона наблюдали следующие изменения: ИФР-1 +6,3 ± 0,9; IGFBP-1 -2,2 ± 0,9; IGFBP-2 -0,3 | 0,2; IGFBP-3 +1,6 ± 0,5 и ALS +2,7± ± 0,5 баллов, по сравнению с соответствующими изменениями в группе, применявшей плацебо: ИФР-1 +0,5 1 0,2; IGFBP-1 -0,8 I 0,4; IGFBP-2 +0,2 ± 0,3; IGFBP-3 +0,1 И 0,3 и ALS +0,1 ± 0,2 бала (рис. 36.3). С использованием отсутствия перекрывания отдельных значений для разделения групп уровень ИФР-1 в сыворотке крови позволяет точно определять лиц, употреблявших рСТГ, во время посещения 4 в 87,5 % случаев и в 100 % случаев при сравнении значений показателей до и после физической нагрузки и, соответственно, в 75 и 87,5 % случаев во время посещения 5 (через 27 ч после последнего применения рСТГ). Подобным образом оценка содержания ALS в сыворотке крови позволяет правильно определить злоупотребление рСТГ в 100 и 87,5 % для временных точек до и после занятия двигательной активностью и 100 и 50 % при оценке во время посещения 5. Уровень IGFBP-3 во всех случаях оказался менее чувствительным.

Интенсивная физическая нагрузка вызывала временное повышение уровня костно-специфической щелочной фосфатазы (BSAP, +16,1 %), С-концевого пептида проколлагена типа I (PIPC, +14,1 %), N-копцевого добавочного пептида проколлагена III (PIIIP, +5,0 %), С-концевого поперечно-сшитого те-лопептида коллагена типа I (ICTP, +9,7 %), изменений остеокальцина при этом не наблюдали (рис. 36.4) (Karila et al., 1999). Эти изменения, безусловно, свидетельствуют о временном повышении интенсивности обменных процессов в костной ткани после занятий аэробными упражнениями с ограничением нагрузки, связанной с перемещением собственного тела в вертикальном направлении. Применение экзогенного рСТГ вызывало увеличение концентрации осгеокальцина, PICP, PIIIP и ICTP в сыворотке крови, изменения уровня последних двух были наиболее выраженными. Время снижения концентрации (исчезновения) вдвое после прекращения применения рСТГ для маркеров до и после физической нагрузки составляло от 248 до 770 ч. Таким образом, маркеры обменных процессов в костной и соединительной ткани могут быть подходящими маркерами применения рСТГ. При интерпретации изменений PIIIP и маркеров обменных процессов в костной ткани следует учитывать характер двигательной активности (аэробный или силовой), наличие восстановительного периода после физической нагрузки и различия в уровне физической подготовленности (Takal Т.Е. et а!., 1986, 1989; Virtanen et al., 1993; Brahm et al., 1996, 1997a, 1997c). Учитывая то, что PIIIP, очевидно, является одним из наиболее обещающих маркеров, обеспечивающих обнаружение допинга с применением СТГ. Следует особо отмстить, что это вещество является маркером обменных процессов в соединительной ткани и травма связочного аппарата может рассматриваться как “фальшивая положительная реакция”.

Чтобы продемонстрировать относительную величину изменений всех форм СТГ, подвергавшихся количественной оценке, их концентрация в сыворотке крови была преобразована в единицы SI и представлена на одном графике.

В гипофизе человека происходит образование нескольких вариантов СТГ, наиболее многочисленным из которых является “22 кДа изоформа гормона”, в меньшем количестве представлены мономерные изоформы с мол. массой 20, 17 и 5 кДа и олигомеры (Baumann, 1991). Подавление образования изоформ гормона с мол. массой, отличной от 22 кДа, после применения экзогенного рСТГ с мол. массой 22 к Да свидетельствует о существовании регуляторной цепи отрицательной обратной связи, в функционировании которой участвует ИФР-I. В сотрудничестве со шведскими и германскими коллегами (Boguszewski et al., 1996; Wu et al., 1999) нами было показано, что в результате выполнения интенсивных аэробных упражнений происходит повышение обеих основных изоформ гормона с мол. массой 20 и 22 кДа (рис. 36.5). Относительное количество последних во время занятия повышалось от 3 до 9 %. Применение рСТГ подавляло индуцированный физической нагрузкой ответ с повышением соотношения “22 кДа изоформа СТГ / суммарный СТГ” и снижением соотношения “изоформы СТГ с мол. массой, отличной от 22 кДа / суммарный СТГ” (рис. 36.6). Практически во всех случаях можно было различить контрольную группы и группу, принимавшую рСТГ, однако эффект применения экзогенного СТГ проявлялся всего лишь на протяжении суток. Таким образом, молекулярные изоформы могут быть использованы для обнаружения применения рСТГ лишь в течение очень короткого времени. В нашем исследовании пригодность количественной оценки содержания СТГ в моче для определения применения рСТГ как допинга оказалась весьма ограниченной (Wallace et al., неопубликованные данные).