Сравнение результатов различных методов

Сравнение активностей генетических и химических вариантов рекомбинантного соматотропина, определявшихся с использованием теста на увеличение массы тела крыс, высокоэффективной рецепторсвязывающей хроматографии и теста клеточной пролиферации является источником полезной информации, которая может иметь важное значение при проведении последующей оценки аналогичных параметров в плазме крови человека после занятий двигательной активностью. Данные табл. (Roswall et al., 1996) демонстрируют высокую активность и хорошее соответствие между результатами оценки отдельных образцов (например, дезамидированного рСТГ и окисленного рСТГ); низкую активность в случае препаратов димеров или обработанного трипсином рСТГ, а также “сверхактивность” в тесте увеличения массы тела крыс двухцепочечного варианта рСТГ. Как указывают Росволл (Roswall et al., 1996) и другие исследователи, о повышенной биологической активности двухцепочечной формы СТГ сообщалось и ранее.

Несмотря на то что тесты клеточной пролиферации, описанные Росволлом и Вала (Roswall et al., 1996; Wadaet al., 1998), еще только предстоит использовать для изучения образцов крови, отобранных до и после физической нагрузки, кажется весьма вероятным, что уже в ближайшее время они сыграют важную роль в изучении функциональной роли соматотропного гормона.

Разнообразие форм соматотропного гормона, циркулирующих в системе кровообращения

Бауман предположил, что в крови человека можно выявить до 100 различных форм соматотропина (Baumann, 1991b). Концепция, согласно которой многочисленные молекулярные формы гормона роста могут возникать в результате посттрансляционных или трансляционных модификаций продукта экспрессии в гипофизе единственного гена GH-N, очевидно, не нова. Пионерские работы, выполненные в лабораториях Льюиса, Сииха, Костьо, Баумана и других исследователей, послужили основой для последующего анализа, проведенного в статье Баумана (Baumann, 1991b). В табл., заимствованной из этой работы, представлены цифры, характеризующие процентную представленность различных форм СТГ через 15 мин после секреции. Многие исследования, результаты которых обобщает эта таблица, были выполнены до того как рекомбинантные технологии получили широкое распространение. Неудивительно поэтому, что многие из этих данных были получены с помощью традиционных биохимических методов.

В литературе представлено множество экспериментальных данных, которые позволяют охарактеризовать химическую природу различных вариантов СТГ. Короткий, но далеко не полный анализ этих работ очень важен для внутреннего понимания механизмов, обеспечивающих гетерогенность СТГ и образование его комплексов, которые могут принимать участие в ответной реакции организма на физическую нагрузку и адаптации. О том, что иммунореактивный соматотропный гормон плазмы включает несколько видов молекул с различной мол. массой, которые можно разделить эксклюзионной хроматографией, было известно более 30 лет назад. В зависимости от порядка их элюции с колонки в прошлом было удобно выделять три основных изомера (варианта) СТГ: малый, большой и очень большой. Физическая природа этих вариантов гормона роста установлена гораздо хуже по сравнению с исследованиями, в которых был использован рекомбинантный белок. Несмотря на это, детальные исследования двух групп ученых под руководством Баумана и Льюиса (Baumann, 1991а, 1991Ь, 1999; Baumann et al., 1994; Lewis et al., 2000), направленные на характеристику большой и очень большой форм гормона, позволили прийти к заключению, что эти варианты представляют собой серии олигомеров. Наличие таких же олигомеров в экстрактах гипофиза человека также подтверждает эту точку зрения, поэтому большинство ученых считает, что при агрегации может происходить образование, по крайней мере, пентамериых комплексов и различия между большими и очень большими вариантами СТГ достаточно условны. Исследователи предпочитают разбивать олигомеры на группы в зависимости от их молекулярной массы, определенной на основании профиля элюции при хроматографии на сефадексе. Помимо олигомеров СТГ, обнаружены еще заряженные формы гормона, появление которых приписывают ацетилированию, дезамидированию или расщеплению СТГ.

Исследования Столара (Stolar et al., 1984) также показывают, что основная масса большого и очень большого варианта СТГ превращается в малую форму СТГ с мол. массой 22 кДа при экстракции и хранении (например, воздействие 4 М тиоционатом калия [KSCN] и два цикла замораживания—оттаивания приводят к превращению 70 % олигомеров в мономер соматотропина). Олигомерные формы гормона, уцелевшие после столь жесткой обработки, мигрируют как отдельные полосы с мол. массой 45, 62, 80 и 110 кДа. Эти формы количественно (почти полностью) превращаются в малую форму гормона после восстановления сульфгидрильных групп. Небольшую часть продукта этой реакции составляет кислая форма СТГ. Вариант СТГ с мол. массой 20 кДа образует главным образом димеры.

Что известно о биологической активности олигомеров фермента? В целом, по результатам тестов с радиорецепторами и на грызунах, считается, что большая форма (димер) имеет пониженную активность. В то же время, по данным иммуиоферментного анализа (Strasburger et al., 1996), димеры при равной молярной концентрации имеют более высокую активность (110 %) по сравнению с мономером, мол. масса которого 22 кДа.

Свойства пяти различных вариантов соматотропина описаны в одном из последних обзоров результатов работы групп Льюиса и Синха (Lewis et al., 2000). Два из них — короткий и длинный пептиды, образующиеся в результате протеолитического расщепления молекулы СТГ между 43-м и 44-м аминокислотными остатками. Данные этих исследователей свидетельствуют в пользу концепции, согласно которой короткий пептид (СТГ[ 1 — 43|) усиливает физиологические эффекты инсулина, а длинный пептид (СТГ|44—1911) обладает антиинсулиновыми свойствами. В действительности они пишут: “Мы считаем, что этот (более крупный) пептид и есть тот самый диабетогенный продукт гипофиза, который так долго не могли найти”.

В экстрактах гипофиза умерших людей и плазме крови был обнаружен пептид с мол. массой около 3 кДа, который проявляет активность в тибиатесте па крысах (Hymer et al., 2000). Этот пептид не является фрагментом СТГ. Связь данного белка с различными формами СТГ, описанными Бауманом, остается неясной (Baumann, 1999). Неполная последовательность этого белка, которая содержит 9—25-й аминокислотные остатки из его средней части, показывает, что он не может быть продуктом расщепления соматотропина. Наиболее интересно, что многие из этих аминокислотных остатков в его составе являются неполярными, а в целом последовательность очень похожа на один из участков молекулы проинсулина. Подобно пептиду С, этот пептид, секретируемый гипофизом, несомненно, также обладает биологической активностью. По неопубликованным данным одной из наших лабораторий (Р.Г.), в экстрактах гипофиза крысы также выявлен небольшой пептид, обнаруживающий положительную реакцию в тибиатесте.