Различные формы соматотропного гормона: возрастающий объем данных

Несмотря на то что уже многие годы известно о стимулирующем воздействии физических упражнений на уровень СТГ в крови, только в последнее время был поставлен вопрос о возможном изменении соотношения различных форм в системе кровообращения под действием физической нагрузки (Nindl et al., 2003). Рассмотрим некоторые предварительные данные, полученные нами в контексте информации, рассмотренной выше. Чтобы проанализировать логическим образом и получить результаты, необходимо учитывать следующие переменные: направленность исследований; тип упражнений (интенсивность/продолжительность); тип определения СТГ; метод, использованный для выделения отдельных форм гормона; специальная обработка образцов крови.

В табл. обобщены результаты разбитых на отдельные группы исследований (в которых участвовали только люди) в соответствии с выбранными нами условиями — в каждом случае образец изучали, хотя бы двумя методами с целью углубления понимания индуцированного упражнениями повышения уровня СТГ в крови, а также оценки количественного соотношения различных форм гормона. Только в одном исследовании (Hymer ct al., 2001) для количественной оценки вариантов СТГ использовали фракционированную плазму, но всех остальных работах изучали только полную плазму.

Экспериментальные данные, накопленные к настоящему времени, свидетельствуют о том, что занятия физическими упражнениями могут изменять активность или молекулярный состав СТГ в крови. Уоллес с коллегами использовали семь различных методов для количественной оценки СТГ у 17 мужчин, занимавшихся аэробной тренировкой, до и после 20 мин велоэргометрии при 80 % V02max, чтобы оценить изменения в содержании различных молекулярных изоформ под воздействием физической нагрузки (Wallace et al., 2001). Сыворотку крови анализировали специфическими антителами к суммарному, гипофизарному, форме 22 кДа, рекомбинатному, не содержащему форму 22 кДа, форме 20 кДа и иммунофункциональному (ИФ) СТГ. Основными результатами этого исследования были выводы о том, что: а) во время и после воздействия физической нафузки происходит повышение содержания в крови всех форм СТГ; б) после прекращения занятия физическими упражнениями преобладающей изоформой был 22 кДа СТГ с мол. массой 73 %; в) соотношение “СТГ, не содержащий формы с 22 кДа” / “суммарный СТГ” и “20 кДа СТГ” / “суммарный СТГ” возрастало, а соотношение “рекомбинантный СТГ" / “гипофизарный СТГ” уменьшалось. Уоллес (Wallace et al., 2001) объяснял увеличение изоформ, отличных от 22 кДа СТГ, более медленным исчезновением 20 кДа и, возможно, других (кроме 22 кДа) форм гормона. В целом результаты, полученные Уоллесом, показывают, что при воздействии интенсивной физической нафузки и в период восстановления происходит изменение соотношения различных изоформ СТГ. Несмотря на то что СТГ с мол. массой 22 кДа был преобладающей молекулярной изоформой, обнаруживаемой в максимальных концентрациях, в период восстановления после воздействия физической нагрузки происходило увеличение других изоформ гормона роста. Это говорит о том, что относительное содержание форм с мол. массой 20 к Да, 17 кДа, а также форм с мол. массой более 22 кДа (димеров, олигомеров и комплексов с серосодержащими белками) после занятий физическими упражнениями возрастает. Авторы предположили, что увеличение доли изоформ с мол. массой, отличающейся от 22 кДа, в период после воздействия физической нагрузки может быть обусловлено дифференциальной секрецией различных изоформ гормона гипофизом, образованием фрагментов, димеров и олигомеров в кровеносной системе, а также различной скоростью клиренса разных форм гормона. Авторы также предположили, что биологический смысл обнаруженных ими явлений может заключаться в повышенном диабетогенном эффекте изоформ СТГ с небольшой молекулярной массой, что может служить механизмом предотвращения гипогликемии в период после физической нагрузки.

Продолжая эксперименты, начатые Уоллесом (Wallace et al., 2001), Химер, Кремер и Ниндл провели исследование, в котором плазму, взятую у 35 женщин до и после интенсивной физической нагрузки (6 подходов приседаний с нафузкой 10 ПМ, с интервалами для отдыха между ними продолжительностью 2 мин), фракционировали с помощью эксюпозионной хроматофафии на фи класса размеров (Hymer et al., 2001). Фракция А содержала молекулы с мол. массой более 60 кДа (предположительно олигомеры и/или мономерный СТГ, связанный с рецептором); фракция В содержала молекулы с мол. массой 30— 60 кДа (предположительно гомо- и гетеродимеры), а в состав фракции С входили молекулы СТГ с мол. массой менее 30 кДа (предположительно смесь изоформ с мол. массой 22, 20, 16, 12 и 5 кДа). После этого все образцы были проанализированы с применением иммуноферментного анализа (Diagnostic Systems Laboratory IFA), радиоиммуномефического анализа (Nichols IRMA) и радиоиммунного анализа (National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, KIDDKD RIA). Кроме того, был проведен анализ всех образцов до и после обработки глутатионом (GSH) с целью определения эффекта химического восстановления дисульфидных связей. Определение иммунореактивности показало, что для фракции А этот показатель составлял 4 —11 % суммарного СТГ плазмы, для фракции В — 22 —45 % и для фракции С — 44—72 %. Существенное увеличение этого показателя, индуцированное физической нагрузкой, обнаружено для низкомолекулярных форм СТГ (30—60 кДа и менее 30 кДа), но не для высокомолекулярной фракции гормона (более 60 к Да). Другим важным результатом стал тот факт, что химическая редукция образцов, взятых после занятий физическими упражнениями, приводила к увеличению иммунореактивного СТГ, по данным тестов Nichols IRMA и KIDDKD RIA, более значительному, чем это наблюдалось для образцов, взятых до занятия. Это говорит о том, что физическая нагрузка может специфически увеличивать секрецию молекул гормона и/или их фрагментов, связанных дисульфидными мостиками. По данным этого исследования, наиболее значительное влияние интенсивная физическая нагрузка оказывает на димерную форму гормона. Поскольку комплексы СТГ и СТГ-связывающего белка имеют большую продолжительность существования по сравнению со свободным гормоном, вполне вероятно, что димерная форма также обладает большей продолжительностью жизни. Таким образом, суммарный эффект увеличения изоформ СТГ в данном диапазоне молекулярных масс может заключаться в продлении биологической активности этих форм в период после занятий физическими упражнениями.

В работе Ниндла и его соавторов (Nindl et al., 2000) были представлены результаты сопоставления воздействия физической нагрузки на иммунофункциональный (ИФ) СТГ по сравнению с иммунореактивным (ИР) СТГ. Сравнивали концентрацию ИФ и ИР СТГ у мужчин и женщин до и после занятий интенсивными силовыми упражнениями (т. е. 6 подходов приседаний с нагрузкой 10 ПМ и продолжительностью интервалов для отдыха между ними 2 мин). Концентрация ИФ СТГ определялась с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA, Diagmostic Systems Laboratories, Webster, TX, USA), который был разработан на основе результатов Сфасбургера (Strasburger et al., 1996), а концентрация ИР СТГ с помощью РИА с моноклональными антителами (Nichols IRMA, San Juan Capistrano, CA, USA). В этой работе и у женщин, и у мужчин было продемонстрировано сходное увеличение для ИР (мужчины: 1,47 по сравнению с 25,0 нг-мл_|; женщины: 4,0 по сравнению с 25.4 нг-мл-1) и для ИФ (мужчины: 0,55 по сравнению с 11,7 нг-мл-1; женщины: 1,94 по сравнению с 10.4 нг-мл-1) СТГ после занятий физическими упражнениями. В то же время содержание ИФ СТГ было существенно ниже, чем ИР СТГ, и у мужчин, и у женщин. Корреляция между значениями ИФ СТГ и ИР СТГ после физической нагрузки составила г = 0,83. Одним из выводов данного исследования стало то, что примерно половина изоформ СТГ, обнаруживаемых методом радиоиммуноанализа (Nichols IRMA), характеризуется отсутствием свободных мест связывания 1 и 2, необходимых для димеризации рецептора, что может свидетельствовать об отсутствии биологической у этой части изоформ гормона биологической активности.

В следующем эксперименте учитывали, что секреция СТГ происходит не постоянно, а имеет пульсообразный характер. У 10 мужчин определяли содержание ИФ СТГ, отбирая кровь для анализа каждые 10 мин с 17.00 до 6.00. Эксперимент повторяли дважды. Забор крови осуществляли в контрольной группе и у лиц, подвергавшихся интенсивной физической нафузке (Nindl et al., 2001). Физическая иа-фузка состояла в выполнении силовых упражнений со значительным объемом нафузки в период с 15.00 до 17.00. ИФ СТГ определяли методом радиоиммуноанализа и ИФА с поликлональными антителами. Для характеристики пульсообразного характера секреции СТГ использовали систему детекции пиков Pulsar. Несмотря на значительную корреляцию результатов оценки с использованием всех трех методов (коэффициент корреляции составлял от 0,85 до 0,95), метод радиоиммуноанализа снова показал более высокую среднюю концентрацию СТГ по сравнению с ИФ СТГ (3,98 и 1,83 нг-мл”1 соответственно). Значения максимальной амплитуды пиков секреции СТГ, определенные методом РИА, также оказались более высокими по сравнению с оценками методом ИФА (8,0 и 4,63 нг-мл-1 соответственно).

Общим для всех этих исследований (Nindl et al., 2001, 2002, 2003) стало то, что для одного и того же образца оценка ИФ СТГ составляла примерно половину значения содержания СТГ, определенного методом РИА (Nichols IRMA), который является одним из наиболее распространенных методов количественного определения СТГ при проведении медицинских анализов в США. Поскольку ИФА позволяет определять только биологически активные формы соматотропного гормона (т. е. только формы СТГ, которые способны индуцировать димеризацию рецептора с последующей передачей сигнала), дополнительные изоформы СТГ, которые выявляет РИА, вероятнее всего, представляют собой фрагменты, биологическая активность которых реализуется без участия рецепторов СТГ. Сообщалось о том, что фрагмент 44 — 191 обнаруживается в сыворотке крови человека в значительных количествах и может даже оказывать антагонистическое действие по отношению к СТГ (Rowlinson et al., 1996). Поскольку этот фрагмент лишен N-концевого участка пептидной цепи, он, вероятнее всего, не детектируется ИФ анализом. В то же время он будет выявляться РИА в зависимости от эпитопов, узнаваемых антителами. Возможно также, что дополнительные изоформы СТГ, выявляемые РИА, представляют собой высокомолекулярные комплексы СТГ (Baumann et al., 1991а; Lewis et al., 2000).

Наши исследования окончательно доказали, что, по крайней мере, часть молекул, выбрасываемых в кровеносное русло в моменты максимальной секреции СТГ, способна инициировать димеризацию рецепторов СТГ, в этом смысле она обладает биологической активностью. С другой стороны, наши данные показывают, что как в контрольной группе, так и после воздействия интенсивной физической нагрузки происходит секреция изоформ СТГ, которые не способны передавать сигнал посредством рецепторов гормона роста. Значительная корреляция результатов иммуноанализа и других методов детекции количества пиков секреции и интервалов между ними позволяет считать, что ИФА дает возможность получать качественно сопоставимую картину колебаний уровня СТГ. Причины количественных различий результатов оценки СТГ разными методами еще предстоит выяснить, однако можно предположить, что они обусловлены существованием различных молекулярных изоформ гормона. Кроме того, свой вклад в различия результатов количественной оценки СТГ могут вносить особенности условий реакции, используемых буферов, индикаторных соединений и стандартных образцов (Wood, 2001).

При проведении ИФА следует учитывать влияние, обусловленное присутствием СТГ-связывающих белков (Strasburger et al., 1996; Nindl et al., 2001). В ИФА для связывания с сайтом 1 молекулы СТГ используют рекомбинантный рецептор соматотропного гормона (recombinant growth hormone binding protein, rGHBP). Можно предположить, что данная система анализа не сможет детектировать молекулы СТГ, которые уже находятся в составе комплекса с GHBP, поскольку участок связывания 1 будет недоступным. Кроме того, при образовании комплекса СТГ со связывающим белком может закрываться доступ для моноклональных антител (тАЬ7В11) к сайту связывания 2. Сообщалось о том, что высокоаффиниый GHBP может подавлять связывание СТГ с рецепторами и проявление биологической активности в экспериментах in vitro посредством конкурирования за лиганд (Strasburger et al., 1996). Если справедливо утверждение о том, что комплекс СТГ и связывающего белка имеет слишком большой размер для проникновения в капиллярный эндотелий и связывания с клеточными рецепторами, отсутствие детекции комплексов СТГ методом ИФА представляет собой дополнительное свидетельство функциональной избирательности ИФА.

Сравнение результатов РИА (IRMA, Nichols) и ИФА (IFA, DSL) было проведено еще в одном исследовании (Rubin et al., 2003), в котором принимали участие 6 мужчин, занимавшихся тренировкой аэробной выносливости. В ходе занятия на тредмиле нагрузку увеличивали постепенно следующим образом; 60 % VO2max — 10 мин; 75 % — 10 мин; 90 % — 10 мин; 100 % — 2 мин. Анализ образцов проводили до и после обработки глутатионом (GSH, 10 мМ 18 ч при комнатной температуре), предназначенным для разрыва дисульфидных связей между возможными олигомерными комплексами СТГ. По данным РИА, концентрация соматотропина возрастала после повышения интенсивности нагрузки до 75 % V02max и оставалась повышенной в течение 30 мин после завершения занятия. При анализе образцов, обработанных GSH, РИА выявлял увеличение концентрации СТГ уже при интенсивности нагрузки 60 % V02max, а сохранение повышенного уровня гормона — на протяжении 45 мин после прекращения занятия. При интенсивности нагрузки 75 % количественные оценки СТГ методом РИА были более высокими для образцов, обработанных GSH. При проведении иммуноферментного анализа не обработанных глутатионом проб повышение уровня СТГ наблюдалось уже при интенсивности нагрузки 60 %, тогда как в пробах, инкубировавшихся с GSH повышение возрастание концентрации СТГ обнаруживалось только при увеличении интенсивности нафузки до 75 % V02max. В обоих группах образцов (обработанных и необработанных GSH) повышенный уровень соматотропина наблюдали в течение 30 мин после завершения занятия физическими упражнениями. Эти результаты говорят о том, что инкубация образцов сыворотки в присутствии глутатиона перед проведением количественной оценки СТГ методом радиоиммунометрического анализа может приводить к разрыву дисульфидных связей, удерживающих комплексы молекул СТГ, и последующему изменению значения содержания общего гормона роста.