Физиологическая роль пептида f

Несмотря на то что пептид F содержит две последовательности Met-энкефалина, он обладает весьма слабым ответом в классических тестах на действие опиатов (Lewis, Stem, 1983), поэтому присутствие последовательностей Met-энкефалина в составе пептида F не обязательно признак наличия энкефалино-подобных функций. Участки пептида F, не имеющие отношения к энкефалину, являются определяющими в отношении его функций, поскольку могут представлять собой основные последовательности для связывания с этой молекулой.

В настоящий момент одним из наиболее важных доводов в пользу необходимости изучения характера секреции пептида F является его взаимодействие с иммунной системой (Hiddinga et al., 1994; Triplctt-McBride ct al., 1998). Кроме того, вполне возможно, что такое взаимодействие может происходить в биологических компартментах крови. Показало, что пептид F взаимодействует с in vitro с Т- и В-клетками (Hiddinga et al., 1994), а также имеет отношение к активации В-клеток и индивидуальному уровню физической подготовленности (Triplett-McBride et al., 1998).

Достаточно большая продолжительность существования пептида F в крови продлевает его биологическую способность к взаимодействию с различными компартментами крови и иммунной системы. Вместе с тем иммунная система не может быть единственным местом воздействия для пептида F. Поскольку в данном направлении исследования все еще продолжаются, могут быть обнаружены и другие ткани-мишени и места воздействия этого фрагмента проэнкефалина.

Сообщалось о возможной роли пептида F в качестве регуляторного нейрогормона иммунной системы (Hiddinga et al., 1994). В отличие от Mеt-энкефалина, который оказывает подавляющее действие на иммунную систему (Johnson et al., 1982; Marotti et al., 1993), пептид F ее стимулирует (Hidinga et al., 1994). Исследования in vitro, проведенные с использованием физиологических концентраций очищенного пептида F, продемонстрировали, что после 15 мин инкубации этого вещества с Т-клетками происходило увеличение формирующих антитела В-клеток в культуре, существенно усиливающее клеточный ответ лимфоцитов, связанный с формированием антигенспецифических антител в ответ на воздействие тринитрофенил-Фиколлом (TNP-Ficoll) в качестве антигена (51 нг-мл'1). Эксперименты на бестимусных мышах с мутацией nude (мышах с замедленным и дефективным развитием Т-клеток) показали, что пептид F непосредственно участвует в модификации иммунного ответа на клеточном уровне (т. е. активации Т-клеток), а не на гуморальном (т. е. продукция антител В-клетками). Эти результаты свидетельствуют о том, что лимфоциты могут быть возможной мишенью для пептида F и их взаимодействие приводит к усилению иммунной функции.

Методы идентификации рецептора пептида f

Конкурентное связывание с налоксоном. Была предпринята попытка непрямой идентификации возможного рецепторного механизма для пептида F посредством конкуренции с налоксоном (Hiddinga et al., 1994). Налоксон является антагонистом для опиатных рецепторов (например, по отношению к [ Met]-энкефалину) (Simonds, 1988). Спленоциты мышей обрабатывали либо пептидом F, либо Met-энкефалином для определения тех молекул, которое оказывают более выраженное влияние на клеточный ответ В-клеток, связанный с формированием антител. Налоксон добавляли в финальной концентрации 0,1; 1,0 и 10,0 мкмоль (т. е. в 10—1000 раз превышающей концентрацию пептида F или Met-энксфалина в плазме). При концентрации 10 нмоль очищенный пептид F и Met-энкефалин соответственно приводили к стимуляции и подавлению образования антител В-клетками. Для активации лимфоцитов антигены (1 %-е эритроциты овцы или TNP-Ficoll) добавляли к культуре в оптимальной (51 нг-мл"1) или субоптимальной концентрации (5 нг-мл"1) через 15 мин инкубации в присутствии налоксона (10 мкмоль) или пептида F (10 нмоль). Налоксон не подавлял формирование антител В-клетками, стимулированное пептидом F. Эго означает, что пептид F может взаимодействовать не с опиоидным рецептором (т. е. рецептором опиоидных пептидов) лимфоцитов, а с другим, природу которого еще предстоит установить. Met-энксфалин вызывал подавление образования антител В-клетками и этот эффект блокировался предварительной инкубацией в присутствии налоксона. Это говорит о том, что энкефалин с небольшой молекулярной массой связывается с опиатным рецептором лимфоцитов (Sibinga, Goldstein, 1988). Для ответа на вопрос, насколько важным фактором является концентрация каждого из исследованных веществ, пептид F и Met-энкефалин добавляли к культуре одновременно в эквимолярной концентрации (10 нмоль) в присутствии налоксона. [Met]-энкефалин снова вызывал подавление образования антител В-клетками, и этот его эффект подавлял налоксон. Однако пептид F стимулировал увеличение выработки антител и налоксон не устранял этого эффекта. Это еще раз предполагает возможность существования различных механизмов взаимодействия с рецепторами одной и той же иммунной клетки. Вполне вероятно, что налоксон ингибирует иммуносупрессивное действие Met-энкефалина, чем усиливает иммуностимулирующий эффект пептида F. Эти данные предполагают также, что несмотря на наличие в составе пептида F последовательностей Met-энкефалина, пептид F, вероятнее всего, не взаимодействует с опиоидными рецепторами лимфоцитов. Возможно, для связывания с рецептором большое значение имеют другие участки пептида F (Roth et al., 1989). Эта серия исследований оказалась очень успешной в определении и локализации возможных мест связывания с рецепторами и/или воздействия пептида F, которые до настоящего времени изучены недостаточно. Результаты подобного рода, а также эффекты пептида F на иммунные клетки обосновывают необходимость дальнейших исследований, поскольку пептид F был обнаружен в поддающихся оценке количествах в таком биологическом компартменте крови, как белые кровяные клетки.

Иммунохимический анализ с использованием проточной цитометрии. Со времени этих исследований в 1980-х гг. разработаны и другие методологические подходы для определения рецептора пептида F на иммунных клетках (Bush et al., 2006). Было обосновано предположение, что иммунные клетки, чувствительные к действию пептида F, должны иметь рецепторы для этого вещества. Для одновременного выявления клеток, обнаруживающих наличие рецептора к пептиду F, и характеристики этого подкласса лейкоцитов был использован метод иммунохимического анализа. Моноклональные антитела, применяемые для идентификации подклассов лейкоцитов человека, имеются в продаже. Для обнаружения пептида F антител не существует. В действительности, эти рецепторы еще даже не охарактеризованы, поэтому был использован косвенный подход с применением порточной цитометрии.

Антитело к гормону (т. е. пептиду F) использовали для обнаружения рецептора, который идентифицировали по наличию взаимодействия с гормоном. Проведена серия экспериментов, включая разнообразные контроли, направленные на оптимизацию системы и проверку ее специфичности. В этих экспериментах варьировали количество пептида F и антител к пептиду F; использовали несколько разных блокирующих буферов для снижения фонового окрашивания; а также проводили проверочные тесты первичных и вторичных антител без добавления экзогенного пептида F. В качестве отрицательного контроля была использована нормальная сыворотка кролика, полученная от нескольких различных животных. Для определения подклассов лейкоцитов использовали технику двойного мечения.

Применяя косвенный подход было обнаружено, что примерно 20—30% лейкоцитов дает позитивный сигнал с антителами на пептид F (Bush et al., 2006). Вторичные антитела не дают никакого сигнала в отсутствие первичных антител, что подтверждает их специфичность. Добавление пептида F к клеткам существенно не изменяет относительного количества клеток, связывающих антитело, что свидетельствует о практически полном насыщении рецепторов эндогенным пептидом. В то же время при использовании вместо первичных антител нормальной сыворотки кролика были получены аналогичные результаты. Маловероятно, что связывание с Fc-peцепторами происходило вследствие преинкубации с сывороткой козы или теленка с целью их блокирования. Нам не удалось добиться снижения связывания нормальной сыворотки кролика до уровня, допускающего определение специфического связывания с пептидом F (Bush et al., 2006). Необходимо проведение дальнейших исследований, направленных на обнаружение рецептора пептида F.