Жидкостная хроматография

По сравнению с газовой, принадлежности для жидкостной хроматографии отличаются значительным разнообразием размеров, наполнителей и, поскольку разделение происходит при переносе в жидком носителе, большим набором органических растворителей и буферов. Помимо того, в жидкостной хроматографии (ЖХ) в зависимости от свойств анализируемых веществ могут применяться несколько различных механизмов разделения (нормально-фазовая, обращенно-фазовая, ионообменная и ситовая). В этом кратком обзоре мы коснемся только обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ ), которая чаще всего используется при проведении анализов с целью допинг-контроля.

Картриджи. Для использования в ЖХ предлагаются картриджи-колонки различного диаметра. После усовершенствования материалов-наполните-лей (т.е. неподвижной фазы, см. ниже) в лабораториях допинг-контроля для анализа низкомолекулярных соединений чаще всего используют колонки длиной 30—120 мм с внутренним диаметром 1,0— 4,6 мм, тогда как в прежние времена для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) применялись гораздо более объемные и длинные колонки. Уменьшение длины колонок стало возможным после появления обладающих высокой специфичностью высокоизбирательных масс-анализаторов, которые позволяют осуществлять разделение веществ на основании их масс-спегара, благодаря чему потребность в оптимальном хроматографическом разделении анализируемых веществ стала не столь актуальной. Кроме того, была существенно повышена производительность колонок для ЖХ, и это значительно сократило время, необходимое для разделения пиков.

Неподвижная фаза. Как отмечалось выше, определяющим фактором в хроматографии являются параметры неподвижной фазы и жидкостная хроматография в этом не исключение. Здесь необходимо учитывать различные характеристики, в частности размер частиц (3—50 мкм), особенности носителя (частицы силикагеля сферической или неправильной формы), наличие химически связанной фазы (например, С4, С8, С18) и размер пор (50—4000 А).

Для оценки характеристики эффективности хроматографической колонки часто используют пара-метр "количество тарелок п" или "высоту тарелки h". Уравнение Ван Деемтера в его простейшем виде описывает обратную взаимосвязь размера частиц и высоты тарелки; это означает, что уменьшение размера частиц ведет к улучшению эффективности хроматографии, а именно разрешения (Yamashita, Fenn, 1984а; Engelhardt et al., 1985). Поэтому существует тенденция к уменьшению размера частиц наряду с использованием очень коротких колонок в высокоскоростной хроматографии для обеспечения требуемого разрешения пиков.

Чаще всего в качестве материала для приготовления неподвижной фазы обратно фазовой хроматографии используется силикагель. Представленные в продаже виды силикагеля отличаются по своим физическим характеристикам, таким, как площадь специфической поверхности, средний диаметр пор, специфический объем пор и форма. Предполагая, что частицы имеют открытые поры цилиндрической формы, можно выразить взаимосвязь между первыми упомянутыми переменными следующим уравнением:

0 = 103 х 4 Vр /Оsp ,

где 0 — средний диаметр пор, нм; Vp — специфический объем пор, млт"1; Оsp — специфическая площадь поверхности, м2т~' (Scott, 1982). При средней площади поверхности, равной около 300 м2т~', и диаметре пор 10 им специфический объем пор будет составлять примерно 1 млт"1. В настоящее время как носитель для создания неподвижной фазы в обращенно-фазовой ЖХ в большинстве случаев используют сферические частицы силикагеля, поскольку с помощью его можно достичь более высокой плотности упаковки по сравнению с частицами неправильной формы, полученными при полимеризации кремниевой кислоты. На поверхности такие частицы несут гидроксильные группы (силанольные остатки), которые могут быть использованы для создания химически привитой фазы; она и будет определять свойства колонки для ВЭЖХ. В продаже представлен широкий выбор разнообразных фаз, позволяющий решать самые различные задачи хроматографического разделения, например, часто используют фазы с привитыми феи ильными С18-, С8- и С4-группами, либо более полярные материалы, такие, как фазы с привитыми циано-, амино- и диольными группами. Более того, созданы еше более сложные системы, позволяющие разделять молекулы-стерсоизомеры одного соединения. Самых последних результатов в области высокопроизводительного хроматографического анализа удалось добиться благодаря созданию так называемой монолитной колонны, представляющей собой единый кусок органического полимера или диоксида кремния со сквозными порами в нем, полученный прямой полимеризацией соответствующих мономеров. Такой материал отличается более высокой стабильностью и, что важно, более высокой производительностью по сравнению с обычными колонками, заполненными отдельными частицами.

Подвижная фаза. В случае ОФГ неподвижная фаза является неполярным, а подвижная — полярным компонентом. Обычно в ОФГ применяют буферные системы, состоящие, например, из KH2PO4/H3PO4 или NaH2РО4 в сочетании с такими органическими растворителями, как метанол или ацетонитрил, которые хорошо подходят для анализа с помощью ультрафиолетовых (УФ) детекторов. В то же время применение ВЭЖХ в сочетании с МС предъявляет более серьезные требования к характеристикам элюэнтов, поскольку в отношении ЖХ существуют ограничения на допустимый диапазон pH, выбор растворителя, содержание добавок в растворителе и скорость подачи элюзита, направленные на достижение оптимальных результатов масс-спектрометрии (Wheeler, 1955). Обычно в случае ионизации при атмосферном давлении (например, злектрораспылением) требуется добавление легколетучих растворителем для предотвращения примесей ионов анализируемого вещества, поэтому часто применяемые фосфатные, боратные или сульфатные добавки здесь не подходят, вместо них используют ацетат аммония, формиат аммония или тетраэтиламмониумгидроксид. Более того, при использовании ионизации электрораспыленном не допускаются ингредиенты, которые дают сильные ионные пары, в результате чего после десорбции происходит нейтрализация ионов. Первостепенное значение имеет поддержание pH, особенно в случае ионизации электрораспылепием, поскольку этот параметр усиливает ионизацию анализируемого вещества. Анализ соединений, имеющих щелочную природу, следует производить при кислом pH, применяя такие добавки, как уксусная или муравьиная кислота в концентрации 0,1 —1,0 X. в то время как соединения с кислотными свойствами (например, карбоновые кислоты) легче ионизируются в щелочной среде, которую можно создать, например, добавлением гидроксида аммония. В числе часто используемых органических растворителей те же, что применяются и при обычной ВЭЖХ без МС. т. с. метанол, этанол и ацетонитрил.